hrvatski

Kloniranje i pročišćavanje reprezentativnih predstavnika porodice enzima aminokiselina: [protein-nosač]-ligaza

Nedavno su opisani enzimi slični seril-tRNA- sintetazama (SerRS) metanogenog tipa nazvani aminokiselina:[protein-nosač]-ligaze (aa:CP- ligaze). Ovi neobični krnji homolozi atipičnih SerRS (aSerRS) nađeni u brojnim bakterijskim genomima koegzistiraju s uobičajenim SerRS bakterijskog tipa. Za razliku od SerRS koje aminoaciliraju odgovarajuću tRNA i osiguravaju neophodne prekursore za biosintezu proteina na ribosomu, aa:CP-ligaze prenose aktiviranu aminokiselinu na fosfopanteteinsku skupinu malih proteina tzv. protein-nosača (CP) koji sudjeluju u drugim biološkim procesima poput neribosomske sinteze peptida. Do sada su biokemijski okarakterizirana tri predstavnika porodice aa:CP- ligaza iz α-proteobakterija, koji se razlikuju po specifičnosti za aminokiseline kao i za pripadni protein-nosač. Na temelju filogenetske analize dostupnih aminokiselinskih sljedova aa:CP-ligaza odabrani su reprezentativni predstavnici ovih enzima s ciljem njihovog kloniranja i pročišćavanja, te ispitivanja strukturne i funkcionalne raznolikosti na nivou cijele porodice. Geni za aa:CP-ligaze ugrađeni su pomoću odgovarajućih restrikcijskih endonukleaza u ekspresijski vektor pod kontrolom sintetskog promotora T7lac inducibilnog IPTG-om. Rekombinantni proteini eksprimirani s His10Arg7Sumo-privjeskom na N- kraju pročišćeni su afinitetnom kromatografijom na koloni Ni-NTA agaroze. Spektrofotometrijskim mjerenjem potvrđena je prisutnost iona cinka u aktivnom mjestu aa:CP- ligaza što upućuje da su rekombinantno proizvedeni proteini dobro strukturirani. Nativni oblici aa:CP-ligaza priređeni su uklanjanjem fuzijskih privjesaka s N-kraja pročišćenih proteina pomoću proteaze HRV 3C, a potom je afinitetnim supročišćavanjem ispitana njihova sposobnost i specifičnost vezanja heterolognih protein-nosača iz Agrobacterium tumefaciens i Bradyrhizobium japonicum. Pokazalo se da su neke aa:CP-ligaze doista neselektivne u izboru makromolekulskog supstrata, dok istovremeno protein-nosač iz B. japonicum stvara interakcije samo s pripadnom aa:CP-ligazom iz istog organizma.

afinitetno supročišćavanje ; aminokiselina:[protein-nosač]-ligaza ; filogenetska analiza ; homolozi aSerRS ; protein-nosač ; seril-tRNA-sintetaza

nije evidentirano