hrvatski

Stanična kultura humanih mioblasta - model za istraživanje metaboličkih miopatija

UVOD Manjak S-adenozilhomocistein hidrolaze (SAHH) dokazan je dosad u devet bolesnika. Iako je klinička slika varijabilna, svi bolesnici koji boluju od ove multisistemske bolesti od rođenja imaju miopatiju i značajno povišenu serumsku aktivnost enzima kreatin kinaze. Za ovu bolest su specifični izrazito povišena serumska koncentracija S-adenozilmetionina i posebno S- adenozilhomocisteina te snižen omjer S- adenozilmetionina/S-adenozilhomocisteina (SAM/SAH) (metilacijski indeks). Za sada dostupno liječenje (dijeta s ograničenim unosom metionina, dodatni unos kreatina, cisteina i fosfatidilkolina) može poboljšati stanje bolesnika, posebice ako se rano započne s liječenjem. Liječenje djeluje na mnoge elemente bolesti, ali u mišićima izostaje repozitivan učinak ili je on mnogo manji. U skladu s tim poboljšavaju se i laboratorijski pokazatelji osim aktivnosti kreatin kinaze (CK-MM, mišićni oblik) koja ostaje značajno povišena. Svjetlosnim mikroskopom vidljivi su znakovi destruktivne miopatije, ali ne u svih bolesnika jednako. CILJ Uspostava kulture mioblasta kao modela koji će omogućiti daljnje proučavanje patogeneze manjka SAHH na razini metabolita, proteina i gena. MATERIJALI I METODE Bioptat skeletnog mišića veličine 1 mm3, usitnjen je skalpelom, u kabinetu za sterilan rad. Uz pomoć enzimatske digestije, izolirani su mioblasti. Stanice su uzgajane u CO2 inkubatoru na 37˚C, u mediju s faktorima rasta (Skeletal Muscle Growth Media) u sterilnim kultivacijskim bočicama 25/75 cm2. Nakon uspostave primarne kulture, medij je mjenjan svaka tri dana. Nakon što su mioblasti postigli konfluenciju 70- 80%, stanice su tripsinizacijom podjeljene u subkulture. REZULTATI Uspostavljena je primarna kultura mioblasta i fibroblasta.Uzgojene su subkulture mioblasta i fibroblasta. Odvojeni su mioblasti od fibroblasta korištenjem magnetskog staničnog separatora (Miltenyi Biotec) i antitijela NCAM i Mouse IgG1. Optimiziran je broj pročišćenih mioblasta u kultivacijskim bočicama. Diferencirani su mioblasti u miotube. Napravljena je baza mioblasta od ranih do kasnih pasaža. Stanice su uskladištene u tekući dušik, oko 1, 5 x 106 mioblasta po ampuli. Provjerena je vijabilnost mioblasta nakon zaleđivanja (oko 80%). Metodom protočne citometrije dokazana je čistoća mioblasta 81, 4% (CD56+/CD45-). ZAKLJUČAK Mogućnost uspostave i pohrane staničnih kultura mioblasta bolesnika s manjkom SAHH preduvjet je za daljnje proučavanje ove kongenitalne miopatije. To je ujedno i put koji otvara mogućnosti za otkrivanje uzroka propadanja mišića i u drugim patološkim stanjima sa smanjenim metilacijskim indeksom i/ili poremećenom metilacijom. Kultura mioblasta otvara nove mogućnosti u području rijetkih bolesti, prvenstveno miopatija. Takav biološki materijal omogućuje studije staničnih i molekularnih mehanizama koje mogu doprinijeti razumijevanju patofiziologije, otkrivanju novih biomarkera i ubrzanju razvoja novih terapijskih pristupa.

Stanična kultura; mioblasti; miotube; miopatije

Rad je izrađen u okviru IPA-projekta (engl. Instrument for Pre-Accession assistance): “Creation of research related infrastructure for Translational Medicine and Applied Genomics” financiranog od Europske unije.