hrvatski

Fluorescencijska svojstva adenilacijske domene tirocidin-sintetaze 1

Tirocidin-sintetaza 1 (TycA) je dio multienzimskog kompleksa neribosomske tirocidin-sintetaze. Adenilacijska domena tirocidin-sintetaze 1 (TycA-A) unutar svoje strukture sadrži pet potencijalno fluorescentnih triptofanskih ostataka. Mjerenjem fluorescencijskih svojstava može se istražiti struktura, komformacija i dinamika proteina. TycA-A uspješno je eksprimirana u bakterijskom soju E. coli XL-Blue. Izolirana je koristeći afinitetnu kromatografiju na Ni-NTA agarozi s HisTrapHP kolonom. Čistoća izoliranog proteina potvrđena je elektroforezom na SDS-poliakrilamidnom gelu. Prirođena ili intrinzična fluorescencija proteina mjerena je spektrofotometrijski uz pomoć uređaja LS 55 (PerkinElmer). Ispitan je utjecaj supstrata, ATP i L–Phe, na fluorescencijska svojstva proteina TycA-A divljeg tipa tijekom gašenja intrinzične fluorescencije proteina kalijevim jodidom i akrilamidom. Dodatak supstrata (L-Phe i ATP) u otopinu dovodi do konformacijske promjene u strukturi proteina uslijed čega emitirajući triptofan postaje manje dostupan za gašenje. Također je ispitan i utjecaj zamjene očuvanog Pro490, alaninom ili glicinom, unutar motiva A9 na konformacijsku stabilnost i otpornost mutiranih proteina pri denaturaciji ureom i gvanidin-hidrokloridom. Dodatak denaturirajućeg sredstva dovodi do odmatanja proteina pri čemu triptofanski ostatci iz hidrofobne okoline prelaze u polarno otapalo, što je popraćeno pomakom inteziteta fluorescencije prema višim valnim duljinama.

adenilacijska domena; denaturacija; fluorescencija; gašenje; tirocidin-sintetaza

nije evidentirano