hrvatski

Utjecaj tiolnog reagensa na aktivnost adenilacijske domene tirodicin-sintetaze 1 divljeg tipa i Ser491Arg mutante

Tirocidin-sintetaza 1 (TycA) predstavlja dio multienzimskog kompleksa neribosomske tirocidin sintetaze. Adenilacijska domena tirocidin-sintetaze 1 (TycA-A) uz utrošak ATP i prisustvo Mg2+ aktivira aminokiselinu L-Phe, koja se nakon vezanja na Ppant kofaktor djelovanjem epimerazne domene prevodi u odgovarajući D-izomer. Za izolaciju TycA-A s histidinskim privjeskom korišten je soj E. coli XL-Blue transformiran plazmidom pQE-60(TycA-A). Pri pročišćavanju proteina korištena je afinitetna kromatografija na Ni-NTA agarozi s HisTrapTMHP kolonom. Potrošnja ATP u enzimskoj reakciji praćena je spetkrofotometrijski, mjerenjem brzine oslobaĎanja anorganskog pirofosfata (PPi). U radu je ispitan utjecaj mutacije Ser491Arg na brzinu enzimske reakcije u ovisnosti o aminokiselinskom supstratu (L-Phe i D-Phe) i prisustvu tiolnih reagensa (DTE, Cys i CoA). Aktivno mjesto TycA-A kao prirodni supstrat prepoznaje L-Phe, te ga čvrsto veže, a konformacijska promjena bolje štiti međprodukt od hidrolize. Brzina otpuštanja, odnosno curenja međuprodukta L-Phe-AMP je zbog toga manja nego za D-Phe koji nije prirodni supstrat. Tiolni reagensi (DTE, Cys, CoA) sadrže –SH skupinu koja vrši tiolizu vezanog supstrata, te poboljšava otpuštanje međuprodukta s aktivnog mjesta TycA-A. Ispitivanja u kojima su se koristili DTE i Cys uz prirodni supstrat L-Phe pokazala su kako nema značajnijeg utjecaja na brzinu enzimske reakcije divljeg tipa i mutante Ser491Arg. Uz D-Phe s DTE i Cys zabilježeno je ubrzanje enzimske aktivnosti usporedivo za divlji tip i mutantu Ser491Arg. Ubrzanje enzimske reakcije uz CoA TycA-A zapaženo je i uz L-Phe i D-Phe. CoA s funkcionalne strane oponaša fosfopanteteinski kofaktor T-domene, te poboljšava aktivnost TycA-A. Mutanta Ser491Arg vrši učinkovitiji prijenos aminoacila na CoA i u prisutnosti prirodnog supstarata L-Phe, čime su potvrđeni rezultati prijašnjih ispitivanja koji upućuju na moguću uključenost A9 regije u drugi korak katalitičke reakcije A-domene.

adenilacijska domena; peptid-sintetaza; tiol

nije evidentirano