engleski

In vivo evidence that R-loops are formed for CRISPR antiviral defense in Escherichia coli

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) i pridruženi proteini Cas predstavljaju nedavno otkriveni mehanizam obrane mnogih bakterija i arheja protiv stranih genetičkih elemenata. Lokus CRISPR sastoji se od ponavljajućih sekvenci razdvojenih razmaknicama koje su homologne sekvencama nekih bakteriofaga i plazmida. CRISPR/Cas sustav u bakteriji Escherichia coli sastoji se od 8 gena: cas1, 2, 3 i casA, B, C, D i E. Proteini CasABCDE zajedno s RNA koja se prepisala s CRISPR lokusa stvaraju kompleks od 405 kDa koji, uz pomoć proteina Cas3, prepoznaje stranu DNA. Proces prepoznavanja se zasniva na stvaranju RNA-DNA hibrida (R-omče) pri čemu se nekomplementarna DNA istiskuje. Smatra se da protein Cas3 cijepa invadirajuću DNA, dok proteini CasABCDE kataliziraju nastanak R-omče neovisno o ATP-u. Međutim, nedavno je pokazano da sam protein Cas3 također može katalizirati nastanak R-omči neovisno o ATP-u. Većina istraživanja CRISPR-Cas imunosti u bakteriji E. coli napravljena je u uvjetima in vitro, ili u uvjetima velike koekspresije proteina Cas i razmaknice s plazmida. U ovom radu koristili smo soj E. coli s ugrađenom razmaknicom protiv faga lambda. Određivanjem efikasnosti zasađivanja faga lambda željeli smo pokazati važnost R-omče u antiviralnoj obrani te potvrditi glavne uloge gena cas3 i cascada u tom procesu. Antiviralna zaštita bila je efikasna samo na nižim temperaturama i najjača u soju bez gena hns gdje geni cascade nisu reprimirani. Dobiveni rezultati pokazuju da protein Cas3 može nadomjestiti nedostatak proteina Cascada u nastanku R-omči i obrnuto u uvjetima kada su R-omče stabilne od razgradnje RNazom H. U nedostatku proteina Cas3, kompleksa Cascade i RNaze H, antiviralni mehanizam nije aktivan i dolazi do pojave plakova. Ovi rezultati potvrđuju da proteini Cas3 i Cascada mogu stvoriti R-omče in vivo.

CRISPR; cas3; cascade; R-loop

Rad je kao sažetak prezentiran i na skupu 3rd Congress of Croatian Geneticists with international participation, održanom od 13-16.05.2012., Krk, Hrvatkja ; objavljen u Knizi sažetaka / Jasna Franekić, Verica Garaj-Vrhovac (ur.). ; Zagreb : Croatian Genetic Society , 2012. ; str. 84-84 ; ISBN 978-953-57128-0-0.