hrvatski

Endocitozni put MHC molekula I razreda u stanicama inficiranim mišjim citomegalovirusom

Cilj istraživanja: Prvenstveni cilj ovoga rada bila je uspostava modela za praćenje putovanja MHC molekula I. razreda, ali i ostalih površinskih molekula, u neinficiranim stanicama i u stanicama inficiranim MCMV divljim-tipom ili različitim mutantama virusa MCMV kojima nedostaje/ju geni čija je funkcija u literaturi opiasana. Poznato je da se MHC-I molekule puno brže uklanjaju sa površine inficirane stanice nego sa površine neinficirane stanice, upravo je stoga mjerena kinetika uklanjanja površinskih MHC-I molekula. Također su istražena načela ulaska MHC-I molekula u put recikliranja te njihov ulazak u degradacijski put, odnosno u kasne endosome. Materijal i metode: U pokusima smo koristili staničnu liniju mišjih embrionalnih fibroblasta (MEF-a). U istraživanjima smo koristili neinficirane i inficirane stanice te određivali možebitne razlike. Slijedeće rekombinante virusa MCMV su korištene: Δm138-MCMV (ΔMC95.15) s delecijom fcr1 (m138) gena , Δie1-MCMV s delecijom egzona 4 ie1 gena, Δie2-MCMV s delecijom ie2 (m128) gena, Δie3-MCMV s delecijom ie3 gena, Δm4m6m152-MCMV s delecijom tri poznata imunoinvaziva koji utječu na sazrijevanje MHC-I molekula te MCMV divlji-tip, koji je kao i gotovo sve MCMV-delecijske mutante proizvedene i umnažan na kulturi MEF porijeklom iz BALB/c miševa. Δie3-MCMV uzgajan je na komplementarnoj NIH3T3 BAM25 staničnoj liniji. U svrhu praćenja MHC-I molekula koristili smo monoklonska protutijela (mPt): MA-215 za konformirane Kd i 34-5-8S za konformirane Dd. Transferinski receptor (TfR) smo pratili pomoću mPt R17, a molekule GM1 pomoću obilježene podjedinice B kolera toksina. Kako bismo utvrdili koji su putovi uključeni u ulazak molekula u stanicu, endosomalno putovanje, recikliranje i degradaciju, koristili smo različite kemijske inhibitore. Kinetiku internalizacije pratili smo protočnom citometrijom, a unutarstanično putovanje konfokalnom mikroskopijom koristeći princip površinskog vezivanja odgovarajućeg mPt i njegovog praćenja nakon određene kinetike internalizacije. Internalizirane molekule kolokalizirali smo međusobno, te s određenim endosomalnim markerima. Recikliranje molekula pratili smo pomoću dva različita protokola metodom protočne citometrije i konfokalne mikroskopije. U cilju identifikacije sudbine površinskih proteina, koristili smo metode površinske biotinilacije, imunoprecipitacije, elektroforeze na poliakrilamidnim gelovima (SDS-PAGE), Western-blota i kemiluminiscencije. Rezultati: Obrazac izražaja MHC-I molekula kako na površini tako i u unutrašnjosti stanice mijenja se u uvjetima MCMV-infekcije. MHC-I molekule nishodno se reguliraju s površine inficirane stanice procesom koji nije isključivo za njih specifičan, potom se nakupljaju u hibridnom odjeljku koji je pozitivan na mnogobrojne biljege unutarstaničnih endosomalnih putova ili odjeljaka (EEA-1+, TfR, GM130). MHC-I molekule internaliziraju se brže u inficiranim nego u neinficiranim stanicama putem koji je neovisan o dinaminu. Niti jedan od ispitivanih kemijskih inhibitora endocitoze (klorpromazin, imipramin, filipin i AlF4-) nije značajnije blokirao internalizaciju MHC-I molekula. Nishodna regulacija MHC-I molekula s površine inficirane stanice je proces 5-6 puta brži od konstitutivne internalizacije te je najvjerojatnije induciran virusnim proteinima. MCMV usmjerava MHC-I molekule nakon internalizacije sa površine stanice, u odjeljak u kojem ih i nakuplja. Internalizirane MHC-I molekule nalaze se u mjehurićima koji ne mogu otpustiti EEA-1 odnosno rane endosomalne membrane, što bi bio jedan od razloga njihovog odgođenog ulaska u endolizosomalni put u proces degradacije. Iz odjeljka koji se formira u MCMV-inficiranim stanicama u kojem se nakupljaju mnogobrojne internalizirane molekule moguće je recikliranje, ali je kapacitet recikliranja smanjen. Retencijski odjeljak sadrži većinom membrane ranih endosoma s obzirom da samo mali dio molekula može reciklirati pri 16 °C i uz prisustvo LY294002, što su karakteristike jukstanuklearnog reciklirajućeg odjeljka. Najvjerojatniji uzrok promjene recikliranja u MCMV-inficiranim stanicama je smanjenje ukupne količine Rab11 molekule te smanjenje mogućnosti stvaranja reciklirajućh membranskih domena. Ulazak u put degradacije za mnoge je molekule odgođen u MCMV-inficiranim stanicama neovisno o njihovu putu ulaska u stanicu te je otežano formiranje endolizosomalnih mebrana. U MCMV-inficiranim stanicama dolazi do promjena u izražavanju pojedinih molekula Rab. Razina Rab5 u inficiranim stanicama ne smanjuje se poput ostalih molekula Rab, te dolazi do otežane pretvorbe Rab5 u Rab7, kao i do smanjenja razine Rab7 u inficiranim stanicama, što za posljedicu ima odgođeno odvođenje molekula u put degradacije. Za nishodnu regulaciju MHC-I molekula s površine inficirane stanice odgovoran je ili ie3 gen ili oni geni koji su pod kontrolom ie3 gena. m06/gp48 protein odgovoran je za usmjeravanje kako novo-sintetiziranih tako i internaliziranih MHC-I molekula u proces degradacije. Zaključak: Endosomalno remodeliranje je mehanizam evoluirao u svrhu MCMV morfogeneze u inficiranih stanica, jer ne utječe samo na MHC-I molekule, nego i na druge endocitirane molekule koje koriste različite endosomalne putove. Ovo remodeliranje se nadopunjuje blokiranjem izlaza MHC-I molekula iz sekretnog puta što dovodi do ubrzanog gubitka MHC-I molekula s površine stanice u ranim razdobljima infekcije.

Endocitoza; MEF stanična linija; MHC molekule I. razreda; Mišji citomegalovirus.

nije evidentirano