hrvatski

Asimetrična ugradnja plazmida u kvaščev lokus ura3

U ovom radu je istraživana ciljana ugradnja lineariziranog plazmida u alel ura3::ARG4 u genomu kvasca Saccharomyces cerevisiae Meyen ex Hansen 1883. Izborom odgovarajućeg restrikcijskog enzima ugradnja se usmjeravala u lokus ura3 uzvodno ili nizvodno od heterologne insercije (gen ARG4), a transformanti su dalje analizirali molekularnim i genetičkim postupcima. Svi, od ukupno 1820 transformanata analiziranih hibridizacijom po Southern-u, su nastali homolognom rekombinacijom, ali su osim usmjerene ugradnje opaženi i drugi rekombinacijski događaji – u prvom redu konverzija heterologne insercije i ugradnja u susjednu, neciljanu homologiju. Istraživan je utjecaj orijentacije heterologne insercije, dužine homologije, prisutnosti točkastih polimorfizama, transkripcije ciljnog gena te utjecaj delecijskih mutacija u genima PMS1 i MSH2, odnosno alela pol3ct na spektar transformacijskih događaja. Polimorfizam rekombinirajućih sljedova imao je najveći utjecaj na nastanak neciljanih transformanata kako kod divljeg tipa (40%), tako i kod mutanta MSH2 (41.2%) ; mutacije u genima PMS1 i MSH2, koji zajedno sudjeluju u popravku nesparenih baza, pokazale su različit utjecaj na učestalost i distribuciju neciljanih događaja. Konverzija heterologne insercije praćena je ugradnjom plazmida u oko 50% slučajeva, a izuzetak čine sojevi s polimorfizmom u slijedu, mutant msh2 te u nekim slučajevima i mutant pms1. Genetička analiza transformanata koji su izgubili heterolognu inserciju (Ura+, Arg-) pokazala se posebno informativnom za istraživanje drugih čimbenika koji utječu na nastanak neciljanih događaja zbog mogućnosti jednostavne analize velikog broja transformanata. Analiza transformanata dobivenih usmjeravanjem plazmida, koji je sadržavao i gen LEU2, omogućila je otkrivanje transformanata kod kojih je došlo do udvostručavanja insercije koje je 2.5-4.5 puta učestalije od gubitka insercije prilikom ugradnje plazmida. Model kojim se mogu objasniti dobiveni rezultati predviđa nastanak jakih paranemskih struktura između homologija koje omogućavaju prijelaz jedne Holliday-eve strukture preko cijele heterologne insercije. Ustanovljeno je i da učinkovitost transfomacije plazmidima ovisi o dužini homologije na dužem kraju linearizirane molekule. Ovaj rad prvenstveno predstavlja doprinos razumijevanju procesa homologne rekombinacije između sljedova koji sadrže insercije/delecije, ali doprinosi i razvijanju postupaka manipuliranja eukeriotskim genomima.

kvasac Saccharomyces cerevisiae; homologna rekombinacija; popravak dvolančanog loma; gensko usmjeravanje; konverija gena; recipročna izmjena; hterologna insercija; položaj dvolančanog loma

nije evidentirano