hrvatski

Optimiziranje metode za određivanje koncentracije malondialdehida u biološkim uzorcima

Malondialdehid (MDA) u organizmu nastaje prilikom lipidne peroksidacije, odnosno kada reaktivni kisikovi spojevi poput peroksid i superoksid radikala razgrađuju višestruko nezasićene masne kiseline pri čemu nastaju razni aldehidi pa tako i MDA. MDA je organski spoj kemijske formule CH2(CHO)2, a u organizmu prevladava njegova enolna forma. Reaktivni je aldehid i jedan je od mnogih reaktivnih elektrofila koji može uzrokovati toksični stres stanice. Također, MDA može stvarati kovalentne adukte s proteinima, ali i s DNA te se zbog toga smatra mutagenim. Koncentracija MDA u plazmi ukazuje nam na oksidativni stres organizma, a koncentracija MDA u pojedinom organu na oksidativni stres u tom organu. Metoda koja se najčešće koristi za određivanje koncentracije MDA u biološkom uzorku je derivatizacija MDA s 2-tiobarbituratnom kiselinom (TBA) pri čemu MDA reagira s dva ekvivalenta TBA i nastaje MDA-(TBA)2 kompleks. Reakcija se odvija u kiselim uvjetima i na visokoj temperaturi pri čemu nastaje crveni fluorenscentni derivat MDA-(TBA)2 čija koncentracija se može izmjeriti spektrofotometrijski. Ta metoda je jednostavna, međutim nije specifična jer i druge tvari (ugljikohidrati, neke aminokiseline i pigmenti žuči) reagiraju s TBA. Metoda se može poboljšati korištenjem tekućinske kromatografije s UV detektorom (HPLC-UV/VIS), pri čemu se na analitičkoj koloni razdvajaju kromogene supstance koje su reagirale s TBA. No, još uvijek se smatra da su uvjeti derivatizacije MDA s TBA (niski pH i visoka temperaura) prestresni. Stoga je cilj našeg istraživanja bio pronaći uvjete pH i temperature prilikom derivatizacije MDA s TBA, koji ne bi bili stresni, a još uvijek derivatizacija bila potpuna. Ispitivali smo različite dužine zagrijavanja uzorka (20, 30, 40, 60 i 80 minuta) te različite pH reakcijske smjese. Naša ispitivanja proveli smo na HPLCu koji se sastojao od HPLC pumpe (model 64, Knauer, Berln, Njemačka), UV detektora (model UV-1, Knauer, Berlin, Njemačka), manualnog injektora s 100µl petljom i analitičke kolone dimenzija 125.0x4.0 mm s predkolonom 4.0x4.0 mm i veličinom punila 5 μm (LiChrospher RP-18, Merck, Darmstadt, Njemačka). Upotrijebili smo mobilnu fazu koja se sastojala od 50 mM KH2PO4 i metanola (60/40 ; v/v). Naša ispitivanja pokazala su da je najoptimalnije pripremanje uzoraka takovo da se u 50 μl uzorka, standarda ili destilirane vode (slijepa proba) doda 400 μl fosforne kiseline (0.1%), 100 μl TBA (0.6%), pH te reakcijske smjese je 1, 94. Uzorci su potom promiješani i zagrijani u termobloku 30 minuta na 90oC. U takvim uvjetima reakcije imali smo zadovoljavajući signal standarda. Tlak je bio oko 10 MPa, a vrijeme zadržavanja MDA-(TBA)2 na koloni oko 1, 5 minuta. Kako bi metodu validirali pripremili smo iz komercijalnog standarda MDA razrjeđivanjem standarde koncentracija 0, 15 ; 0, 75 ; 1, 5 ; 3 μM. Baždarni pravac bio je linearan, a faktor korelacije (r2) bio je 0, 993. Ponovljivost u seriji bila je 2, 9 %, a ponovljivost iz dana u dan 3, 6 %.

lipidna peroksidacija; malondialdehid; HPLC; validacija

nije evidentirano