hrvatski

Genetska raznolikost bakterija mliječne kiseline izoliranih iz autohtonog Istarskog ovčjeg sira

Istarski sir pripada skupini tvrdih sireva koji se proizvodi od sirovog ovčjeg mlijeka bez upotrebe komercijalne mikrobne kulture. Tradicijski sirevi, poput Istarskog ovčjeg sira, predstavljaju vrijedan izvor mikrobne raznolikosti čija je dinamika tijekom zrenja uvjetovana brojnim faktorima od kojih je posebno značajna tehnologija izrade te karakteristike ekološkog područja na kojem se odvija proizvodnja. Dominantnu autohtonu mikrobnu populaciju bakterija mliječne kiseline (NSLAB) čine vrste roda Enterococcus i Lactobacillus koje su odgovorne za specifičnost Istarskog ovčjeg sira. Uzorkovanje mlijeka i sira provodilo se na tri gospodarstva na području Istre koja proizvode sir na tradicionalan način. Uzorci mlijeka i svježeg sira prikupljeni su nultog dana, dok su uzorci sira uzorkovani tijekom 30., 60., 90. i 120-tog dana zrenja. Za izolaciju autohtone mezofilne i termofilne populacije laktobacila i enterokoka iz mlijeka i sira primjenjene su standardne mikrobiološke metode. Za karakterizaciju izolata laktobacila i enterokoka dodatno su korišteni fiziološki i biokemijski testovi. Osnovne PCR metode i njene modifikacije korištene su za preciznu genetičku karakterizaciju izolata na razini roda, vrste i soja, dok je za praćenje ukupne zajednice laktobacila i enterokoka izraslih na pločama korištena DGGE metoda. Metoda kvantitatativnog PCR u stvarnom vremenu korištena je za određivanje brojnosti ukupne zajednice laktobacila i enterokoka direktno izoliranih iz sira. Fenotipskom i genotipskom identifikacijom utvrđena je pripadnost odabranih izolata rodovima Enterococcus i Lactobacillus. Primjenom RAPD metode pripadnici roda Enterococcus su preliminarno grupirani, dok su pomoću multiplex PCR metode s vrsno specifičnim početnicama utvrđene njihove dominantne vrste E. faecalis i E. faecium. Fenotipskom karakterizacijom pomoću PhP (Phene Plate) sustava preliminarno su grupirani izolati laktobacila. Reprezentativni PhP izolati su precizno identificirani temeljem sekvencijske analize 16S rDNA te su identificirane slijedeće vrste laktobacila Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei i Lactobacillus rhamnosus. Raznolikost ukupne zajednice (konzorcija) laktobacila i enterokoka izraslih na pločama praćena je analizom varijabile V3 regije 16S rDNA pomoću PCR DGGE metode. Dominantnu zajednicu enterokoka čine vrste E. faecium, E. faecalis što je podudarno s rezultatima pojedinačno karakteriziranih izolata te je dodatno utvrđeno prisustvo vrste E. durans. Rezultati PCR DGGE analize zajednice laktobacila pokazali su izuzetan polimorfizam vrpci te je utvrđena kompleksna mikrobna zajednica u kojoj prevladavaju vrste Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Streptococcus sp. i Leuconostoc mesenteroides. Direktnom izolacijom DNA iz uzoraka mlijeka i sira uz primjenu kvantitativne Real Time PCR analize kvantificirana je ukupna populacije enterokoka i laktobacila. Utvrđeno je da između broja laktobacila i enterokoka postoje statistički značajne razlike obzirom na faze zrenja. Najmanji broj ovih skupina zabilježen je u mlijeku, dok je najviši izmjeren u sirevima nakon 120-og dana zrenja. Precizno definirana zajednica laktobacila i enterokoka te genetički identificirani pojedinačni izolati temelj su očuvanja autohtonog genetskog potencijala bakterija mliječne kiseline i osnova za opis autohtonog Istarskog sira u cilju njegove zaštite.

Istarski ovčji sir; Lactobacillus; Enterococcus; PCR; PCR DGGE; kvantitativni Real Time PCR

nije evidentirano