hrvatski

Dijagnostika virusa denge: Molekularne metode

Virus denge obuhvaća četiri serotipa i pripada porodici Flaviviridae, rod Flavivirus. Genom virusa denge se sastoji od jednolančane RNK pozitivnog polariteta. Za dijagnostiku je važno u kojoj fazi bolesti se bolesnik nalazi. U prvoj fazi, koja je karakterizirana viremijom i vrućicom unutar prvih 4-6 dana, dijagnostika se obavlja putem izravne virusne izolacije, te dokazivanjem virusnih nukleinskih kiselina ili dokazivanjem virusnog proteina. Tijekom rane post-febrilne faze akutne bolesti nestaje viremija i pojavljuju se specifična protutijela. Tada je optimalna metoda dokazivanja serološka, tijekom dokazivanja specifičnih protutijela. Iako je virusna izolacija zlatni standard za dijagnostiku, zbog brže dostupnosti rezultata razvijeni su razni testovi amplifikacije nukleinskih kiselina. Ovi testovi omogućavaju dokaz virusnih kiselina iz pune krvi, seruma ili drugih tkiva. Nakon izolacije, virusna RNK mora se prevesti u cDNK pomoću enzima reverzne transkriptaze. Ta cDNK se koristi kao kalup u PCR reakciji, kojom se može umnožiti tražena sekvencija pomoću specifičnih početnica. Takozvana RT-PCR u jednom koraku ubrzava reakciju, smanjuje mogućnosti kontaminacije te povećava senzitivnost. Osjetljivost se može dodatno povećati putem 'nested PCR' tijekom kojeg se koristi produkt iz prvog RT-PCR-a kao kalup za sljedeći PCR. Početnice su tako izabrane da se odjednom obavlja serotipizacija virusa. Kvantifikacija koncentracije virusa u uzorku se određuje putem RealTime-PCR-a. U načelu je to PCR koji se izvodi u posebnom aparatu. Fluorescentnim mjerenjem su u stvarnom vremenu moguće i detekcija i kvantifikacija amplificirane DNK. Osim kvantifikacije dodatna prednost je brzina testa. Tome nasuprot stoji viša cijena tehnike i reagensa. Daljnja upotreba produkta, npr. za sekvenciranje i genotipizaciju virusa, nakon RealTime-PCR nije moguća. U klasičnom PCR-u, RT-PCR-u, 'nested PCR-u' i RealTime-PCR-u se koristi po jedan par početnica. To dozvoljava amplifikaciju jednog produkta. Multipleks eseji koriste više parova početnica unutar iste reakcije. Tako je moguće umnožiti više raznih sekvencija. Pažljiva optimizacija reakcijskih parametara omogućuje istodobno, u jednoj reakciji, testiranje na sva četiri serotipa virusa denge. Drugi eseji su optimizirani s više parova početnica za dokazivanje drugih virusa koji se prenose komarcima, kao što je npr. virus zapadnog Nila, virus žute groznice, virus Chikungunya, itd., te tako značajno olakšavaju diferencijalnu dijagnostiku. Multipleks eseji se mogu temeljiti na klasičnom PCR-u, 'nestedPCR-u' ili RealTime PCR-u. Prvi autohtoni slučajevi denge groznice u Hrvatskoj su dokazani pomoću RT-nestedPCR-a, tijekom kojeg je u drugom PCR-u istodobno određen i serotip virusa (DENV-1). Umnoženi produkt je sekvenciran i usporedbom s drugim sekvencijama srodnih virusa denge oblikovano je filogenetsko stablo koje omogućuje genotipizaciju tih prvih slučajeva na području Republike Hrvatske.

virus denge; dijagnostika; PCR; RT-PCR; filogeneza

nije evidentirano