hrvatski

Potencijalni inhibitori auksin-amidohidrolaze iz kineskog kupusa (Brassica rapa L.)

Auksini su biljni hormoni izuzetno važni u regulaciji biljnog rasta i razvitka. Auksin- amidohidrolaze su enzimi koji sudjeluju u reverzibilnoj konjugaciji, procesu koji doprinosi homeostazi auksina u biljkama. Djeluju na način da hidroliziraju aminokiselinske konjugate auksina oslobađajući slobodne, aktivne forme. Predmet istraživanja diplomskog rada je auksin- amidohidrolaza iz kineskog kupusa (Brassica rapa L.), BrILL2. Enzim je do sada okarakteriziran s obzirom na supstratnu specifičnost te je dokazano da je konjugat alanina i indol-3-propionske kiseline (IPA-Ala) njegov najpogodniji supstrat. Cilj ovog rada bio je ispitati dva konjugata indol-3-propionske kiseline: IPA--Ala i IPA-Asp kao potencijalne inhibitore enzima. U tu je svrhu rekombinantni protein BrILL2 proizveden prekomjernom ekspresijom u bakteriji Escherichia coli. Enzim je izoliran i pročišćen metodom afinitetne kromatografije pomoću Ni-NTA agaroze. Uspješnost izolacije i pročišćavanja provjerena je metodom elektroforeze u poliakrilamidnom gelu u denaturirajućim uvjetima (SDS-PAGE). Koncentracija proteina određena je metodom po Bradfordu. Inhibitorni učinak konjugata IPA--Ala i IPA-Asp ispitan je provođenjem enzimskih reakcija s IPA- Ala kao supstratom. Produkti reakcije analizirani su metodom tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (HPLC) te je određena specifična aktivnost enzima BrILL2. IPA--Ala i IPA-Asp prisutni u enzimskoj reakciji uzrokovali su smanjenje specifične aktivnosti enzima, što upućuje na njihovo inhibicijsko djelovanje. U svrhu određivanja termodinamičkih parametara za reakciju vezanja IPA--Ala i enzima BrILL2 provedeni su preliminarni mikrokalorimetrijski eksperimenti. Korištenjem programa PyMOL predložen je model 3D strukture enzima BrILL2 na temelju kristalne strukture auksin-amidohidrolaze iz uročnjaka (Arabidopsis thaliana L.).

Auksin-amidohidrolaza ; Brassica rapa L. ; specifična aktivnost enzima ; enzim BrILL2 ; konjugati auksina ; IPA--Ala ; IPA-Asp ; inhibitori

nije evidentirano