hrvatski

Apoptotičke promjene u kulturi životinjskih stanica i mehanizmi djelovanja endogenih i egzogenih faktora

Proliferacija životinjskih stanica u kulturi pod kontrolom je faktora rasta, koji su sadržani u serumu sisavaca dodanim u medij za uzgoj stanica. Faktori rasta su specifični za određeni tip stanica, djeluju na rast stanica te mogu imati ulogu fizioloških regulatora u brojnim procesima u stanici. U dosadašnjem radu Laboratorija za tehnologiju i primjenu stanica i biotransformacije izoliran je faktor rasta iz svinjskog mozga te je dokazan njegov pozitivan učinak na rast BHK-21 [C-13] stanica te veća vijabilnost stanica inficiranih virusom bolesti Aujeszkoga. U ovom radu je primjenom metoda Western-blot analize, N-terminalnog sekvenciranja i spektrometrije masa dokazan identitet pročišćenog i izoliranog faktora rasta. Na temelju N-terminalne sekvence i spektrometrije masa te pretraživanjem sličnosti u dostupnim bazama podataka izolirani protein identificiran je kao kiseli fibroblastni faktor rasta (aFGF). Osim ovog proteina identificiran je još jedan protein iz porodice fibroblastnih faktora rasta i to HBGF-8 (heparin binding growth factor-8), koji često putuje na koloni za afinitetnu kromatografiju zajedno s aFGF. Budući da dodatak egzogenih faktora rasta može utjecati na proliferaciju, ali i odumiranje stanica u kulturi ispitan je učinak sirovog ekstrakta svinjskog mozga (SE) na proliferaciju stanica primarne kulture ovarija i uterusa štakora pri čemu je zapažen značajan stimulatorni učinak na rast stanica u obje kulture. Također je provedeno ispitivanje na staničnim linijama CCO (Channel Catfish Ovary) i CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary) gdje je dodatak SE ili frakcija sakupljenih nakon ionsko-zamjenske kromatografije (F3), imao pozitivan učinak na rast stanica, međutim nije zapažena značajna razlika između djelovanja SE i F3. Zapaženi stimulatorni učinak SE na rast stanica bio je izraženiji u primarnim kulturama nego u staničnim linijama. Također je istraženo može li dodatak SE ili F3 djelovati protektivno na CHO-K1 stanice tretirane 17α-etinilestradiolom (EE2) ili dietilstilbestrolom (DES), za koje je dokazan citotoksični učinak na tim istim stanicama, no pozitivan učinak SE i F3 na preživljavanje stanica nije dokazan. Životinjske stanice u kulturi na promjene uvjeta uzgoja ili utjecaje iz okoline, kao npr. djelovanje raznih ksenobiotika kojima smo svakodnevno izloženi, reagiraju na razne načine među ostalim i odumiranjem stanica. Budući da posljednjih godina raste zabrinutost javnosti zbog zapaženih promjena u reproduktivnom sustavu ljudi i životinja, a osobito riba, izazvanih djelovanjem endokrinih modulatora u ovom je radu ispitano djelovanje sintetskih estrogena EE2 i DES na rast CCO i CHO-K1 stanica te mehanizmi staničnog odgovora. Citotoksičnost je ispitana metodama: tripan plavo, MTT i Neutral Red, a promjene u morfološkom izgledu stanica praćene su bojanjem kristal ljubičastim i hematoksilin-eozinom. Unatoč razlikama u dobivenim rezultatima, ovisno o primjenjenoj metodi, može se zaključiti da su oba spoja u obje stanične linije, pri koncentracijama 1 μg/mL i veće, djelovala citotoksično s vidljivim morfološkim promjenama u tretiranim stanicama. Iz podataka ovisnosti postotka preživljavanja o koncentraciji EE2, odnosno DES-a izračunate su IC50 vrijednosti za sva tri testa citotoksičnosti i obje stanične linije te je uspoređen in vitro učinak ispitivanih spojeva na staničnu liniju riba i sisavaca. CHO-K1 stanice su pokazale nešto veću osjetljivost prema djelovanju EE2 i DES-a, no obje stanične linije su pogodne za preliminarna ispitivanja citotoksičnosti endokrinih modulatora. Obzirom na zapaženi citotoksični učinak EE2 i DES-a te uočene morfološke promjene ispitano je koji tip stanične smrti induciraju ti spojevi u CCO i CHO-K1 stanicama. Rezultati fluorescentne mikroskopije i bojanja stanica fluorescein diacetatom i propidijevim jodidom, TUNEL metode te kvantitativne analize stanica protočnom citometrijom pokazali su da je zapažena citotoksičnost EE2 posljedica indukcije stanične smrti procesom apoptoze, dok DES inducira nekrozu u obje stanične linije.

CCO stanice; CHO-K1 stanice; citotoksičnost; dietilstilbestrol; 17α-etinilestradiol; kiseli fibroblastni faktor rasta; primarna kultura stanica; sirovi ekstrakt svinjskog mozga; stanična smrt

nije evidentirano