hrvatski

Usmjerena mutageneza gena za tirocidin-sintetazu 1

Tirocidin sintetaza spada u skupinu neribosomskih peptid sintetaza (NRPS) koje pronalazimo kod gljivica, bakterija i nižih eukariota. Građena je od tri multifunkcionalna enzima koja su uključena u biosintezu cikličkog dekapeptida tirocidina A: tirocidin sintetaza 1 (TycA), tirocidin sintetaza 2 (TycB) i tirocidin sintetaza 3 (TycC). Tirocidin sintetaza je multienzimski kompleks koji se sastoji od niza različitih modularnih dijelova, pri čemu je svaki modul odgovoran za ugradnju jednog aminokiselinskog ostatka u peptidni produkt. Module možemo podijeliti u katalitičke domene, od kojih je svaka odgovorna za specifičan korak tijekom sinteze peptida. Razlikujemo tri vrste modula: inicijacijski, elongacijski i terminacijski. Inicijacijski modul je građen od adenilacijske (A), peptidil-nosač-protein (PCP) i epimerizacijske (E) domene. Elongacijski modul je građen od adenilacijske (A), peptidil-nosač-protein (PCP) i kondenzacijske (C) domene, a terminacijski modul je građen od kondenzacijske (C), adenilacijske (A), peptidil-nosač-protein (PCP) i tioesterazne (TE) domene. A-domena je odgovorna za selekciju specifičnog aminkiselinskog supstrata i njegovu aktivaciju kao aminoacil-O-AMP uz sudjelovanje ATP-a. PCP-domena je mjesto vezanja kofaktora. Svaka PCP-domena mora biti postranslacijski modificirana s 4'-fosfopanteteinskim kofaktorom, na kojega su za vrijeme sinteze peptida svi supstrati i peptidni međuprodukti kovalentno vezani u obliku tioestera. C-domena unutar elongacijskog modula (C-A-PCP) je mjesto gdje se stvara peptidna veza. Broj C-domena obično se podudara s brojem peptidnih veza u produktu. Postoji i četvrta katalitička jedinica, tioesterazna (TE) domena. Za razliku od prethodne tri domene, koje se ponavljaju u svakom elongacijskom modulu, TE-domena katalizira otpuštanje produkta i zbog toga se kod većine peptid sintetaza nalazi samo u C-terminalnom modulu. Ovaj rad usredotočen je na A-domenu tirocidin sintetaze 1 (TycA), te je njime napravljena podloga za daljnja istraživanja na toj domeni. A-domena sadrži deset visokoočuvanih slijedova, od kojih je A9 slijed {;484LpxYM(IV)P490}; predmet interesa u ovom radu. Njegova funkcija je još uvijek nepoznata. U ovom radu uspješno je iskorištena metoda usmjerene mutageneze kako bi se uvelo osam mutacija u A9 regiju A-domene tirocidin sintetaze 1 (TycA). Mutacije koje su uvedene su: Pro490Ala, Pro490Gly, Try487Ala, Pro487Ala, Leu484Ala, Pro485Gly, Met488Ala, Ser491Arg. Prvo smo započeli s pretraživanjem bakterijskih kolonija u kojima se nalazi plazmid pQE-60 s ukloniranim genom za A-domenu tirocidin sintetaze 1 (TycA). Trebalo je ustanoviti koje bakterijske stanice sadrže plazmid s genom za tirocidin sintetazu 1, a koje ne. To je rađeno na način da je izolirana plazmidna DNA bakterijskih stanica, izvršena je restrikcijska analiza na izoliranoj plazmidnoj DNA, te su potom uzorci plazmidne DNA stavljeni na agarozni gel. Uzorci plazmidne DNA koji su na gelu pokazali da sadrže gen za tirocidin sintetazu 1 (TycA), radi dodatne potvrde poslani su na sekvenciranje. Nakon izolacije plazmida koji sadrži gen za tirocidin sintetazu 1 (TycA), metodom usmjerene mutageneze uvedene su mutacije u A9 regiju A-domene tirocidin sintetaze 1 (TycA). Nakon reakcije mutageneze izvršena je transformacija superkompetentnih XL1 Blue stanica s plazmidom koji sarži gen za A-domenu tirocidin sintetaze 1, a u kojega je uspješno uvedena mutacija. Reakcije mutageneze i transformacije stanica izvedene su osam puta dok nisu uvedene sve mutacije, jedna po jedna. Radi potvrde da je svih osam mutacija uspješno uvedeno, izolirana je plazmidna DNA, te su uzorci poslani na sekvenciranje. Cilj rada je postignut, a to je uspješno uvođenje svih osam mutacija u visokoočuvanu A9 regiju A-domene tirocidin sintetaze 1 (TycA).

mutageneza; tirocidin-sintetaza 1

nije evidentirano