hrvatski

Heterologna ekspresija i pročišćavanje tirocidin-sintetaze 1

Tirocidin sintetaza 1 dio je multienzimskog kompleksa neribosomske tirocidin sintetaze. Kodirana je samo jednim genom te obuhvaća prvi (inicijalni) modul građen od tri domene: A (adenilacijske), T (PCP ; tiolacijske) i E (epimerazne). Adenilacijska domena odabire supstrat i aktivira ga, potom taj aktivirani supstrat prihvaća PPan „ruka“ T-domene koja ga prenosi do posljednje epimerazne domene koja L-izomer epimerizira u D-izomer. Soj XL1-Blue bakterije Escherichia coli poslužio je za heterolognu ekspresiju tirocidin sintetaze 1 kodirane genom koji je smješten u pGC12 plazmidu veličine 6, 2 kb. Soj BL21(DE3) bakterije Escherichia coli omogućio nam je heterolognu ekspresiju api i holo T-domene tirocidin sintetaze 1 koja je kodirana genom smještenim u pQE60 plazmidu veličine 3, 4 kb koji na C-terminalnom kraju nosi šest histidina (His-tag). U ovom radu uzgojena je kultura bakterijskih stanica E. coli u kojima je inducirana sinteza cijelog prvog modula te odvojene T-domene tirocidin sintetaze 1, nakon čega su proteini izolirani i pročišćeni kromatografijom. Cijeli prvi modul pročišćen je dvjema kromatografijama, kromatografijom na stupcu za hidrofobnu interakciju i ion-izmjenjivačkom kromatografijom. Kod hidrofobne kromatografije dolazi do interakcije uzorka sa slabo hidrofobnom stacionarnom fazom, pri visokoj koncentraciji soli. To je moguće jer pri visokoj koncentraciji soli, inače zaštićeni hidrofobni dijelovi proteina, postaju izloženi i mogu stupiti u dodir s hidrofobnim dijelovima matriksa. Elucija se izvrši smanjenjem koncentracije soli. Ion-izmjenjivačka kromatografija slijedi odmah nakon hidrofobne, a zasniva se na reverzibilnoj interakciji nabijenog proteina i suprotno nabijenog medija kolone, pri čemu se ciljni proteini koncentriraju, a potom ispiru i sakupljaju u pročišćenom obliku. Apo i holo T-domena izolirana je te pročišćena afinitetnom kromatografijom. Histidinski privjesak na C-terminalnom kraju omogućava reverzibilno vezanje proteina za kolonu od nikla. U svrhu određivanja koncentracije dobivenih uzoraka prije i nakon kromatografije, korištena je metoda po Bradfordu. Uzorci iz različitih faza izoliranja i pročišćavanja naneseni su na SDS-poliakrilamidni gel kako bi se elektroforezom provjerila čistoća pojedinih uzoraka u odnosu na standard. Izmjerene vrijednosti koncentracija divljeg tipa (c = 491 µg/mL), M488A mutante (c = 291 µg/ml) i L484A mutante (c = 282 µg/ml) TycA su zadovoljavajuće. Isto tako, koncentracija apo (c = 400 µg/ml) i holo (c = 403 µg/ml) oblika T-domene su zadovoljavajuće. Ostvaren je cilj ovog diplomskog rada - svi enzimi su uspješno pročišćeni tj. zadovoljavajuće su čistoće i koncentracije. Dobiveni rezultati mogu poslužiti za buduća istraživanja u svrhu proučavanja interakcija između domena TycA.

tirocidin-sintetaza 1; pročišćavanje proteina

nije evidentirano