hrvatski

Endocitozni put i recikliranje MHC molekula I razreda

Cilj istraživanja: Prvenstveni cilj ovoga rada bila je karakterizacija konstitutivne internalizacije konformiranih i nekonformiranih MHC molekula I razreda, odnosno karakterizacija njihove endocitoze, recikliranja i degradacije. Poznato je da razlika u konformaciji MHC-I molekula uzrokuje njihovo razdvajanje u sekretornom putu. Stoga su u ovom radu istražena načela njihova razdvajanja tijekom endocitoze i putovanja kroz endosomalne odjeljke. Na temelju eksperimentalnih mjerenja cilj nam je bio i uspostavljanje matematičkog modela za kinetičku analizu endosomalnih putova. Materijal i metode: Istraživanja smo proveli na mišjim fibroblastima J26 transficiranim s genom koji kodira molekule HLA-B7 (J26-B7), HLA-Cw6 (J26-Cw6) ili HLA-G1 (J26-G1), na humanoj tumorskoj staničnoj liniji HeLa koja konstitutivno izražava sve klasične HLA molekule I razreda, Balb 3T3 mišjim fibroblastima, te L-Ld stanicama (mišji fibroblasti transficirani genom za molekule H2-Ld). Za praćenje MHC molekula I razreda koristili smo monoklonska protutijela (mPt): mPt W6/32, koje prepoznaje sve klasične konformirane HLA molekule i konformirane HLA-G1 molekule, mPt HC-10, koje prepoznaje sve klasične nekonformirane HLA molekule, mPt MEM-G/1 koje prepoznaje nekonformirane molekule HLA-G1, mPt 30-5-7 koje prepoznaje konformirane H2-Ld molekule, te mPt 64-3-7 koje prepoznaje nekonformirane H2-Ld molekule. Transferinski receptor (TfR) smo pratili pomoću mPt R17, a molekule GM1 pomoću obilježene podjedinice B kolera toksina. Neionski detergent Triton X-100 nam je poslužio za ispitivanje nazočnosti molekula u lipidnim splavima. Oponašanjem uvjeta endosomalnog pH izvan stanice, utvrdili smo promjenu konformacije MHC molekula I razreda u zadanim uvjetima. Kako bismo utvrdili koji putovi su uključeni u endocitozu, endosomalno putovanje, recikliranje i degradaciju ovih molekula, koristili smo različite kemijske inhibitore. Kinetiku internalizacije pratili smo protočnom citometrijom, a unutarstanično putovanje konfokalnom mikroskopijom koristeći princip površinskog vezivanja odgovarajućeg monoklonskog protutijela i njegovog praćenja nakon određene kinetike internalizacije. Internalizirane molekule kolokalizirali smo međusobno, te s određenim endosomalnim markerima. Recikliranje molekula pratili smo modificirajući tri različita protokola iz literature i to protočnom citometrijom i konfokalnom mikroskopijom. U cilju praćenja kinetike degradacije koristili smo metodu površinske biotinilacije, te imunoprecipitacije, elektroforeze na poliakrilamidnim gelovima (SDS-PAGE), Western-blota i kemiluminiscencije. Za matematičko modeliranje i simulacije endocitoznih procesa koristili smo programski paket Mathematica (Wolfram Research Europe Ltd.). Rezultati: Konformirane MHC-I molekule dobro su izražene na staničnoj površini za razliku od nekonformiranih molekula. Djelovanjem kiselog pH (fiziološke i nefiziološke vrijednosti) izražaj konformiranih MHC-I molekula pada, dok izražaj nekonformiranih raste. Različite konformacije MHC-I molekula u ustaljenom stanju samo djelomično se kolokaliziraju unutar stanice i to prvenstveno u ranim endosomalnim odjeljcima. Niti jedan od ispitivanih kemijskih inhibitora (klorpromazin, Dynasore, filipin i AlF4-) nije blokirao internalizaciju MHC-I molekula. Nekonformirane MHC-I molekule se znatno brže internaliziraju i degradiraju od konformiranih MHC-I molekula što je najvjerojatnije posljedica činjenice da se konformirane MHC-I molekule usmjeravaju u reciklirajuće odjeljke, a nekonformirane MHC-I molekule u degradacijski put. Tome u prilog govori rezultat da se konformirane MHC-I molekule nakon internalizacije nalaze prvenstveno u jukstanuklearnom području zajedno s Tf/TfR i Rab11 GTPazom, dobro poznatim biljezima jukstanuklearnih reciklirajućih endosoma. Internalizirane konformirane MHC-I recikliraju s učinkovitošću od oko 30%, znatno manje od TfR/Tf koji recikliraju s učinkovitošću od 85-99%, što ukazuje da konformirane MHC-I molekule ulaze u zasebne reciklirajuće odjeljke. Ubrzo nakon internalizacije konformirane i nekonformirane MHC-I se kolokaliziraju s biljegom ranih endosoma (EEA-1), kao i međusobno, ali nedugo zatim stupanj kolokalizacije se smanjuje što znači da se razmjerno brzo razdvajaju. To razdvajanje blokira LY294002 (blokator PI3K), kao i konkanamicin A (blokator endosomalne H+ crpke). Djelovanjem Tx-ispiru se konformirane MHC-I molekula i TfR sa staničnih membrana, dok se nekonformirane MHC-I molekule i GM1 ne ispiru. Matematičkim modeliranjem potvrđeni su eksperimentalni rezultati, te izračunati slijedeći parametri: stopa endocitoze, stopa recikliranja i stopa degradacije. Zaključak: Konformirane MHC-I molekule kao i TfR nalaze se u detergent-osjetljivim membranskim mikrodomenama za razliku od nekonformiranih MHC-I molekula i GM1, kako na staničnoj površini tako i u unutrašnjosti stanice. Internalizacija MHC-I molekula nije ovisna o klatrinu i dinaminu, već najvjerojatnije o funkciji malih GTPaza (Cdc42 i Arf6). Sortiranje, odnosno odvajanje endosomalnih putova konformiranih i nekonformiranih MHC-I molekula odvija se na razini ranih endosoma i ovisno je o pH. Nakon sortiranja konformirane MHC-I molekule se prvenstveno usmjeravaju u recikliranje, a nekonformirane u degradaciju. Ključne riječi: Endosomalno recikliranje ; Internalizacija, endocitoza ; Lipidne splavi ; Matematičko modeliranje ; MHC molekule I razreda ; Sortiranje proteina ; Vezikularni transport.

Endosomalno recikliranje; Internalizacija; endocitoza; Lipidne splavi; Matematičko modeliranje; MHC molekule I razreda; Sortiranje proteina; Vezikularni transport.

nije evidentirano