hrvatski

Seril-tRNA-sintetaza iz kvasca Saccharomyces cerevisiae: evolucijske prilagodbe i mehanizam djelovanja

Seril-tRNA-sintetaze iz različitih organizama podvrgnute su strogoj filogenetskoj analizi koja je otkrila parafiletsko porijeklo ovih enzima iz današnjih Archaea, uz konvencionalno grupiranje ostalih organizama. Anomalije u evolucijskom stablu poslužile su kao osnova za lociranje nepouzdano modeliranih regija u modelnim strukturama. Seril-tRNA-sintetaza iz kvasca Saccharomyces cerevisiae divljeg tipa, te mutirani enzim s delecijom 20 aminokiselina na C-kraju koje čine bazični produžetak svojstven eukariotskim seril-tRNA-sintetazama, prekomjerno su eksprimirani u kvascu s odgovarajućih gena indukcijom GAL-promotora u plazmidu pCJ11, te pročišćeni iz staničnog ekstrakta u dva kromatografska koraka na ionskoizmjenjivačkim stupcima uređaja za FPLC. Poredbena kinetička analiza reakcije aminoaciliranja i reakcije izmjene pirofosfata za mutirani i enzim divljega tipa pokazuje da 1) nema razlike u kinetičkim parametrima između dvaju enzima za izmjenu pirofosfata tj. u odsutnosti tRNA i 2) pri reakciji aminoaciliranja enzim s delecijom na C-kraju pokazuje povećan afinitet za tRNA, četverostruko smanjen afinitet za serin, te za red veličine smanjen afinitet za nemodificiranu pripadnu tRNA proizvedenu transkripcijom in vitro. Ovo se objašnjava izmjenjenim mehanizmom prepoznavanja supstrata kod enzima s delecijom, odnosno djelomičnim dokidanjem prepoznavanja serina ovisnog o tRNA. Western-analizom staničnih ekstrakata kvasaca i pokusima termička inaktivacije enzima uočeno je da je enzim s delecijom na C-kraju vrlo nestabilan. In vitro, kvaščeva tRNA specifična za serin štiti enzim od termičke inaktivacije na 42°C, kao i tRNA prisutne u staničnom ekstraktu kvasca. Nestabilnost enzima i poremećeno prepoznavanje supstrata izravno su odgovorni za uočenu toksičnost mutiranog enzima za stanicu u kojoj se eksprimira. MALDI-masenom spektrometrijom kvaščeve seril-tRNA-sintetaze prekomjerno eksprimirane u kvascu i fragmenata dobivenih njezinom specifičnom digestijom pokazano je moguće postojanje krupne posttranslacijske modifikacije na ovom enzimu.

molekularna evolucija; modeliranje proteina; seril-tRNA-sintetaza; kvasac; enzimska kinetika; MALDI-MS; razgradnja proteina

nije evidentirano