hrvatski

Kvantitativna analiza agregacije rekombinantnih humanih proteina

U ovom radu kvalitativno i kvantitativno je opisan proces agregacije rekombinantnog humanog proteina rHuG-CSF pomoću ortogonalnih tehnika gel-filtracijske kromatografije (SEC tehnika) i razdvajanja protočnim poljem (FFF tehnika). Ispitivano je kako različiti uvjeti pohrane i proces protresivanja utječu na stabilnost proteina. Povišena temperatura i proces protresivanja uzrokuju konformacijske promjene proteina (poput djelomičnog odmatanja) koje smanjuju stabilnost proteina u otopinama, te vode njihovoj agregaciji. Uzorci rHuG-CSF su bili pohranjeni na povišenoj temperaturi od 40 °C odnosno na 2-8 °C. Praćenjem uvjeta pohrane u vremenu od 12 tjedana, primijećeno je da je udio agregata rHuG-CSF vremenom narastao do najviše izmjerenih 9, 15 %. Također, porast udjela agregata, dimera, trimera i tetramera primjećen je uslijed povećanja vremena protresivanja, kojem je uzorak rHuG-CSF bio podvrgnut neposredno prije analize SEC tehnikom. U ovom radu ispitivana je i kinetika procesa agregacije uzoraka rHuG-CSF podvrgnutih protresivanju. Rezultati su pokazali da se proces agregacije sastoji od dva dijela: prvog, bržeg dijela koji prati kinetiku drugog reda i kojim dominiraju procesi nastanka dimera i nestanka monomera, te drugog, sporijeg dijela gdje se daljnja agregacija opisuje ustaljenim stanjem, jer nastaje gotovo konstantna koncentracija trimera, tetramera dok agregat nastaje konstantnom brzinom. SEC tehnikom su izračunate molekulske mase oligomera i agregata prema jednadžbi kalibracijske krivulje koja je dobivena iz točaka vremena zadržavanja gel- filtracijskih standarada (aprotinina, citokroma C, ugljične-anhidraze, albumina i plavog dekstrana). Izračunate molekulske mase oligomera su se razlikovale od pretpostavljenih vrijednosti unutar 4 %. Ovim istraživanjem pokazano je da nastali agregati imaju molekulsku masu zasigurno veću od 600 000 Da.

rHuG-CSF ; FFF ; SEC ; agregacija ; kinetika

nije evidentirano