hrvatski

Poliklonska protutijela na endocitozne vezikule iz kore bubrega štakora

Endocitoza u stanicama proksimalnih kanalića (PK) bubrega je složen proces odgovoran za reapsorpciju proteina male molekulske mase koji dospjevaju u tubule filtracijom u glomerulima. Središnju ulogu u tim procesima imaju specijalizirane unutarstanične organele - endocitozne vezikule (EV) - putem kojih se također recikliraju različiti prijenosnici, čime se neprekidno održava i mijenja sastav luminalne (četkaste, ČM) membrane PK. Postojećim metodama izolacije EV nije moguće dobiti potpuno čiste pripravke EV bez većeg ili manjeg onečišćenja drugim (unutar)staničnim membranama/organelama. Stoga je svrha ovog rada bila da se proizvedu specifična poliklonska protutijela na izolirane EV, koja bi se potom uporabila za imunoizolaciju istih, te da se ispita mogućnost njihove primjene u istraživanju funkcije i morfologije različitih stanica nefrona u sisavaca. Izolirala sam EV iz homogenata tkiva bubrežne kore štakora slijedom diferencijalnog centrifugiranja i primjenom gradijenta gustoće Percolla. Nakon funkcijske i enzimske karakterizacije, dobivenim pripravkom EV imunizirala sam kuniće. Proizvedene imune serume provjerila sam metodom posredne imunofluorescencije na 4 mu debelim narescima smrznutog fiksiranog tkiva bubrega štakora i našla da su serumi jako obilježili apikalnu stranu stanica PK (ČM i EV), ali i neke druge unutarstanične organele. Analiza imunoblota na proteinima ČM i EV pokazala je da su serumi različito obilježili proteine ČM i EV; najjače je obilježeno 9 različitih proteinskih pruga Mr 16-276 kDa. Svaku od ovih serumom-obilježenih pruga upotrijebila sam za imunoadsorpciju specifičnih protutijela. Iz seruma sam izdvojila 9 različitih protutijela, koja sam potom pojedinačno karakterizirala. Pokusi imunoblotiranja s imunopročišćenim protutijelima pokazali su da sva protutijela za proteine velike molekulske mase (55, 90, 104 i 276 kDa) jače obilježavaju odgovarajuće proteine ČM, dok protutijela za proteine male molekulske mase (16, 18, 19, 25 i 36 kDa) jače obilježavaju proteine EV. Rezultati imunocitokemijske analize pokazali su da niti jedno poliklonsko protutijelo nije specifično obilježilo samo EV. Međutim, pročišćena protutijela za proteine male Mr su, osim EV, obilježila i odgovarajuće proteine krvne plazme, koji su filtrirani i endocitirani u stanicama PK i čine sadržaj EV. Protutijelo za protein od 104 kDa obilježilo je, osim ČM u PK štakorskog bubrega, i različite stanične strukture u drugim organima štakora, te četkastu membranu PK i bazolateralnu membranu sabirnih kanalića u ljudskom bubregu. Konačno, imunocitokemijski nalazi s primijenjenim protutijelom za protein od 104 kDa na smrznutim narescima bubrega štakora obrađenih kadmij-metalotioneinom (Cd-MT) ukazali su na smanjenje ukupnog sadržaja odgovarajućeg proteina u ČM u odnosu na kontrolne životinje. Na osnovi dobivenih rezultata zaključila sam da poliklonska protutijela na EV iz kore bubrega štakora nisu specifično obilježila EV, te se kao takva ne mogu upotrijebiti za imunopročišćavanje istih. Neka od imunopročišćenih protutijela moguće je koristiti za studiranje specifičnih antigena u organelama stanica PK štakorskog i ljudskog bubrega i za praćenje toksičnih učinaka u eksperimentalnoj nefrotoksičnosti izazvanoj teškim metalima.

bubreg; endocitotne vezikule; protutijela; štakor

nije evidentirano