hrvatski

Purin nukleozid fosforilaza iz bakterije Escherichia coli: Provjera modela katalitičkog djelovanja

Purin nukleozid fosforilaza (PNPaza) važan je enzim u metabolizmu purina u stanicama. PNPaza iz bakterije Escherichia coli posebno je zanimljiva, jer se pokazala dobrim kandidatom za gensku terapiju čvrstih tumora (Zhang Y. i sur., Curr. Top. Med. Chem 2005). Na osnovu kristalne strukture ternarnog kompleksa PNPaze iz E. coli s derivatima formicina A i fosfatnih odnosno sulfatnih iona, predložen je model mehanizma djelovanja ovog enzima (Koellner G. i sur., J. Mol. Biol. 2002). U svrhu njegove eksperimentalne provjere, pripremljeni su mutanti aktivnog mjesta: Asp204Ala, Asp204Asn, Arg24Ala, Arg217Ala te dvojni mutant D204A/R217A. Prekomjerno su eksprimirani u BL21 (DE3) bakterijskim stanicama E. coli, izolirani te pročišćeni do čistoće od ~ 99%. Preliminarna biofizička ispitivanja pokazuju da sve mutirane aminokiseline (Arg24, Asp204, Arg217) imaju važnu ulogu u katalitičkom djelovanju, jer se njihovom mutacijom u alanin aktivnost enzima prema prirodnim supstratima (Ino, Guo, Ado) smanjuje za najmanje sto puta, dok je aktivnost prema 7-metiliranom supstratu (m7Guo) tri puta veća od aktivnosti divljeg tipa. Ovo dokazuje ispravnost predloženog protoniranja na položaju N(7) purina (Koellner G. i sur., J. Mol. Biol. 2002). Preliminarni rezultati također ukazuju na zajedničko djelovanje aminokiselina Asp204 i Arg217 u procesu protoniranja s obzirom da dvojni mutant Asp204Ala/Arg217Ala pokazuje sličnu aktivnosti kao Asp204Ala mutant tj. jedna mutacija ima isti učinak kao i dvije.

PNPaza iz E. coli; mehanizam katalize

nije evidentirano