hrvatski

SORTIRANJE KONFORMIRANIH I NEKONFORMIRANIH GLIKOPROTEINA U MEMBRANSKE MIKRODOMENE

Cilj istraživanja: Osnovni cilj istraživanja nam je bio uspostaviti model za izučavanje sortiranja i smještanja staničnih glikoproteina i ostalih molekula, kako u membranske mikrodomene, tako i u funkcionalne domene endocitoznih odjeljaka, te ustanoviti kako konformacija molekule utječe na taj proces. Pored toga, željeli smo ispitati kako se konformirane i nekonformirane molekule normalno razmještaju u staničnim organelama i endosomalnim odjeljcima, te istražiti mogućnost prelaska nestabilne konformacije MHC molekula I razreda (MHC-I molekule) u stabilnu, tj. mogućnost i mehanizam alternativnog načina antigenskog predočavanja. Materijal i metode: U pokusima smo koristili mišje stanične linije haplotipa H-2d - mastocitom P815, mišje L fibroblaste transficirane genom koji kodira za molekule Ld (stanice L-Ld) i mišje fibroblaste Balb 3T3. U svrhu praćenja MHC-I molekula koristili smo monoklonska protutijela (mPt) MA-215 za konformirane molekule Kd, 34-5-8S za konformirane molekule Dd, 34-2-12S za konformirane i nekonformirane molekule Dd, 30-5-7 za konformirane molekule Ld i 64-3-7 za nekonformirane molekule Ld. Transferinski receptor (TfR) smo pratili pomoću mPt R17, a molekule GM1 pomoću obilježene podjedinice B kolera toksina. Ne-ionski detergenti (Triton X-100, CHAPS, Brij 96 i Tween 20) su nam poslužili za ispitivanje nazočnosti molekula u lipidnim splavima. Kako bismo utvrdili koji putovi su uključeni u prijenos, transformaciju i opću dinamiku ovih molekula, koristili smo različite kemijske inhibitore endocitoze, vezikularnog transporta i staničnog signaliranja. Kinetiku uklanjanja sa stanične površine pratili smo protočnom citometrijom, a unutarstanične molekule konfokalnom mikroskopijom koristeći princip površinskog vezivanja odgovarajućeg monoklonskog protutijela i njegovog praćenja nakon određene kinetike internalizacije. Internalizirane molekule kolokalizirali smo međusobno, te s određenim endosomalnim markerima. U cilju identifikacije sudbine površinskih proteina koristili smo metodu površinske biotinilacije, te imunoprecipitacije, elektoforeza na poliakrilamidnim gelovima (SDS-PAGE), Western-blota i kemiluminiscencije. Na kraju, oponašanjem uvjeta endosomalnog pH izvan stanice, utvrdili smo međusoban odnos punih i praznih molekula Ld, odnosno promjenu njihove konformacije u zadanim uvjetima. Rezultati: Nekonformirane MHC-I molekule se, jednako kao i GM1, ne uklanjaju nakon tretmana ne-ionskim detergentima, za razliku od konformiranih molekula i TfR. Međutim, na staničnoj površini konformirane MHC-I molekule se ne kolokaliziraju s TfR, a nekonformirane molekule se slabo kolokaliziraju s GM1. Nadalje, utvrdili smo da molekule unutar svojih mikrodomena nisu statične, već se premještaju iz jedne domene u drugu ovisno o konformaciji. Konformirane i nekonformirane MHC-I molekule se međusobno slabo kolokaliziraju unutar stanice, bilo da se prate u ustaljenom stanju (steady state), bilo nakon internalizacije, a međusobno se razlikuju i prema načinu endocitoze. Naime, dok je endocitoza nekonformiranih MHC-I molekula zakočena djelovanjem filipina, te prema tome, ovisna o nakupljenosti kolesterola (lipidnim splavima), konformirane MHC-I molekule se endocitiraju masovnim putem (bulk pathway), kojeg ne inhibira niti djelovanje filipina, niti klorpromazina (inhibitor klatrinske endocitoze). Međutim, ubrzo nakon internalizacije, konformirane i nekonformirane MHC-I molekula se kolokaliziraju s EEA1 (marker ranih endosoma), ali i međusobno. Nakon toga stupanj kolokalizacije se opet smanjuje: konformirane MHC-I molekule se pretežno recikliraju i kolokaliziraju s TfR, a nekonformirane molekule se pretežno kolokaliziraju s markerima kasnih odjeljaka (Lamp1 i LBPA). Ipak, u konačnici, i konformirane molekule ulaze LBPA i Lamp1 odjeljke. Degradacija MHC-I molekula je samo djelomično zakočena primjenom inhibitora endosomalnog zakiseljavanja (bafilomicin A1 i konkanamicin A), što upućuje da se jedan dio uklanja i egzocitozom. Također, inhibitori normalnog ustroja staničnog citoskeleta (nokodazol, taksol, latrunkulin A, citohalazin D) narušavaju normalan obrazac izražaja MHC-I molekula, što navodi da unutarstanični razmještai konformiranih i nekonformiranih MHC-I molekula ovisi o citoskeletu, prije svega mikrotubulima. Nadalje, utvrdili smo da molekule Ld mogu prelaziti iz jedne konformacije u drugu. Endosomalnom alkalizacijom (korištenjem bafilomicina A1), utvrdili smo da nekonformirane molekule Ld mogu nastati raspadom konformiranih molekula Ld, kako u sekretornom, tako i u endocitoznom putu, a inhibicijom endocitoze nekonformiranih molekula Ld smanjio se površinski izražaj konformiranih molekula, što ukazuje da je moguć i obrnut proces. Na kraju, ustanovili smo da se nekonformirane molekule Ld nakupljaju i neko vrijeme zadržavaju u kiselom retencijskom odjeljku (ELRC) koji se djelomično do znatno kolokalizira s markerima kasnih endosomalnih odjeljaka, ali ne i s markerima sekretornog puta, EEA1 i TfR. Nadalje, slabo se kolokaliziraju s internaliziranim i steady state konformiranim MHC-I molekulama, ali znatno s endocitiranim nekonformiranim molekulama Ld. Njegov izgled je promijenjen nakon djelovanja inhibitora citoskeleta, endosomalnog zakiseljavanja, te PI(3) kinaze (LY294002). Zaključak: Osnovna mjesta sortiranja membranskih makromolekula tijekom njihovog endocitoznog puta su: plazma membrana, rani endosomi i kasni odjeljci. Utvrdili smo da se MHC-I molekule općenito različito sortiraju, ovisno o konformaciji. Tako se nekonformirane MHC-I molekule uglavnom nalaze u membranskim mikrodomenama otpornim na djelovanje detergenata, endocitiraju se na način ovisan o kolesterolu i uglavnom upućuju u kasne odjeljke. Suprotno tome, konformirane MHC-I molekule se nalaze u membranskim mikrodomenama osjetljivim na djelovanje detergenata, endocitiraju se masovnim putem, a potom se uglavnom recikliraju. Nadalje, molekule Ld mogu prelaziti iz jedne konformacije u drugu, procesom koji bi mogao poslužiti u alternativnom mehanizmu antigenskog predočavanja. Na kraju, nekonformirane MHC-I molekule se nalaze u retencijskom odjeljku koji je sličan kasnim odjeljcima, a dinamika njegovog punjenja i pražnjenja znatno ovisi o mikrotubulima, pH, te PI(3)K.

Endocitoza; endosomi; vezikularni transport; Konformirane i nekonformirane molekule; Membranske mikrodomene; lipidne splavi; MHC molekule I razreda; molekule Ld; Sortiranje proteina.

nije evidentirano