hrvatski

Konstrukcija heterodimera arhealne seril-tRNA- sintetaze i biokemijska analiza komunikacije proteinskih domena

Seril-tRNA-sintetaze (SerRS) iz metanogenih arheja uvelike se razlikuju od SerRS bakterijskog tipa pronađenog u većini organizama. Rješavanjem strukture utvrđeno je da homodimerna SerRS metanogenih arheja posjeduje cink u aktivnom mjestu, novu domenu za vezanje tRNASer (N- terminalna domena) i jedinstvenu inserciju unutar katalitičke domene (HTH motiv). Cilj ovog rada bio je proučiti utjecaj motiva HTH na orijentaciju N- domene i stabilnost dimera. Konstruirani su i pročišćeni slijedeći mutirani oblici SerRS metanogenog tipa: N-terminalna domena mMbSerRS, C- terminalna domena mMbSerRS, heterodimeri između cjelovitog polipeptidnog lanca divljeg tipa i C- terminalne domene mMbSerRS, odnosno C-terminalne domene mMbSerRS bez motiva HTH. Pokazano je da samostojeća C-terminalna domena ne sadrži cink u aktivnom mjestu, što je posljedica nepravilne strukture. Koekspresijom N- i C- terminalnih domena dobivena je pravilno svijena C-domena. Nadalje, dodatkom N-terminalne domene u smjesu za aminoaciliranje sa C-domenom dolazi do serilacije tRNASer. Koekspresijom proteina divljeg tipa (mMbSerRS) i C-terminalne domene mMbSerRS dokazano je stvaranje navedenih heterodimera. Heterodimerni proteini su uspješno razdvojeni elektroforezom na agaroznom nativnom gelu, iz kojeg su zatim izolirani i testirana im je aktivnost. Heterodimer koji sadrži C-terminalnu domenu s motivom HTH pokazuje serilacijsku aktivnost i ima sposobnost vezanja tRNASer, dok je enzimska aktivnost heterodimera s C-terminalnom domenom koja ne sadrži motiv HTH izrazito niska. Može se zaključiti da motiv HTH jedne podjedinice djeluje na N-terminalnu domenu druge podjedinice, usmjeravajući je u pravilan položaj za vezanje tRNASer, omogućujući tako aminoacilaciju.

seril-tRNA-sintetaza ; Methanosarcina barkeri ; N- i C- terminalna domena ; heterodimer ; afinitetna kromatografija

nije evidentirano