hrvatski

Zamjena Gln83 s leucinom alkalne fosfataze Escherichia coli usmjerenom mutagenezom PhoA gena

Alkalna fosfataza je nespecifična fosfomonoesteraza koja hidrolizira veliki broj fosfatnih monoestera. Prisutna je u večini živih bića, a optimalnu aktivnost postiže u alkalnom području. Mnogi proteini sastavljani su od više podjedinca te posjeduju više veznih mjesta za ligande. U nekim slučajevima, vezanje liganda za takav enzim ne pokorava se Michaelis- Menten modelu, pa grafički prikaz ovisnosti brzine o koncentraciji supstrata na jedno vezno mjesto izaziva promjenu konformacije proteina koja utječe na kinetička svojstva susjedne podjedinice. U ovom radu uspješno je iskorištena metoda točkaste mutageneze kako bi se izvršila zamjena polarnih aminokiselinskih ostataka Thr81 i Gln83, nepolarnim aminokiselinama alaninom odnosno leucinom, te kako bi se uvelo novo restrikcijsko mjesto za TURBO NaeI. Ovako je onemogućeno stvaranje vodikovih veza. Kao DNA kalup korišten je ekspresijski vektor pET11d+phoA. Kako se selekcijski i mutageni oligonukleotidi moraju nalaziti na istom lancu, od ponuđena dva selekcijska oligonukleotida, odabran je onaj koji se označava kao TOP STRAND. Plazmid pET11d+phoA prethodno se podvrgne reakciji alkalne denaturacije, a potom reakciji mutacije. Mutirani plazmid potom se transformira u soj E.coli koji ne posjeduje mehanizme popravka BMH 71-18 mutS, kako bi se postigla veća vjerojatnost zadržavanja mutacija. Plazmid se potom izolira i ponovno iskoristi za transformaciju kompetentnih JM109 stanica. Te stanice osiguravaju pravilnu segregaciju mutiranih plazmida i plazmida divljeg tipa. Osim spomenutih mutacija u plazmid je uvedeno i novo restrikcijko mjesto za enzim TURBO NaeI. Ovo svojstvo iskorišteno je prilikom analize tranformanata. Od osam ispitanih kolonija, tri su nosile mutaciju. Nemutirani plazmid restrikcijskom analizom daje četiri fragmenta veličine 5019, 1588, 354 i 160, a mutirani plazmid pet fragmenata veličine 4574, 1588, 445, 354 i 160 pb. Cilj rada je postignut, a to je uspješno uvođenje mutacije.

alkalna fosfataza; usmjerena mutageneza

nije evidentirano