hrvatski

Konstrukcija mutanata kukuruzne citosolne seril-tRNA-sintetaze s izmijenjenom C-terminalnom regijom

Kao i ostale eukariotske citosolne seril-tRNA-sintetaze (SerRS), kukuruzna seril-tRNA-sintetaza sadrži C-terminalni produžetak koji nije prisutan kod arhealnih i eubakterijskih homologa. Cilj ovog rada bio je dobiti seriju mutanata kukuruzne citosolne seril-tRNA-sintetaze (Zmc SerRS) s mutacijama uvedenim na C-terminalnom produžetku i usporediti njihovu katalitičku aktivnost s enzimom divljeg tipa. Mutageneza je bila provedena lančanom reakcijom polimerazom, nakon čega su geni koji kodiraju željene proteine ugrađeni u bakterijske i kvaščeve ekspresijeke vektore. Svi rekombinantni proteini su imali fuzioniran His6-afinitetni privjesak na N-kraju proteina što je omogućilo njihovo pročišćavanje iz staničnog ekstrakta afinitetnom kromatografijom na Ni-NTA agarozi. Rekombinantni proteini, nadeksprimirani u bakteriji Escherichia coli s odgovarajućih gena indukcijom T7lac promotora u plazmidu pET28b imali su visoku razinu ekspresije, te otprilike jednaku katalitičku aktivnost, koja je, međutim, bila upola manja od aktivnosti kvaščeve nativne SerRS, da bi je potpuno izgubili nakon jednog dana inkubacije pri 0oC. Takav gubitak nije primjećen kod Zmc SerRS eksprimirane u E. coli, no bez His6-privjeska, niti kod His6- Zmc SerRS konstrukta eksprimiranog u kvascu Saccharomyces cerevisiae, što upućuje na to da His6-afinitetni privjesak ima negativan utjecaj na strukturu i aktivnost Zmc SerRS eksprimirane u E. coli, te da je kvasac prikladniji ekspresijski sustav za His6- Zmc SerRS konstrukte. Rekombinantni proteini nadeksprimirani su u kvascu s odgovarajućih gena indukcijom GAL promotora u plazmidu pCJ11, pri čemu je uspješno eksprimirano pet od sedam konstrukata. Dobiveni proteini su imali otprilike jednaku razinu ekspresije, te jednaku enzimsku aktivnost, koja je bila oko tri puta veća od aktivnosti kvaščeve nativne SerRS, što ukazuje na to da uklanjanje 70% C-terminalnog produžetka, te mutacije unutar tog područja ne utječu na aktivnost kukuruzne citosolne seril-tRNA-sintetaze.

seril-tRNA-sintetaza; C-terminalni produžetak; Escherichia coli; afinitetna kromatografija; rekombinantni proteini; Saccharomyces cerevisiae

nije evidentirano