hrvatski

Uspostava trajne kulture tumorskih stanica ekspresijom gena za telomerazu

Kultura animalnih stanica je tehnika koja pruža niz prednosti i pogodnosti u znanstvenim istraživanjima. Za produljeni rad i reproducibilne rezultate kroz dulji vremenski period poželjno je uspostaviti trajnu kulturu stanica. Za postizanje tog cilja, istraživaču su na raspolaganju brojne tehnike, jedna od kojih je i unos i ekspresija gena za telomerazu. Sama tehnika je već opisana u znanstvenoj literaturi a moj cilj je uvesti ju u laboratorijsku praksu te definirati i prilagoditi radne uvjete. Koristio sam stanice za produkciju retrovirusa Phoenix. Transfekcijom tih stanica plazmidom pBabe-puro-hTERT konstruirao sam odgovarajuće retrovirusne vektore s kojima sam pokušao transfecirati neustaljenu kultura plućnog tumora i time uspostaviti kulturu stanica s neograničenim diobenim potencijalom.. Sam korak produkcije retrovirusa je bio uspješan, ali pojavili su se problemi vezani uz infektivnost istih. Zbog toga nisam bio u mogućnosti provesti sve isprva zamišljene korake (npr. određivanje titra transfekcijom stanica NIH 3T3 retrovirusima) već sam morao razmišljati o dodatnim postupcima kojima bih postigao krajnji cilj a koji nisu dio standardnih protokola. Radeći na tome došao sam do pobližih spoznaja o granicama tolerancije standardnih protokola i varijablama koje utječu na krajnji ishod pokusa. Na temelju stečenog iskustva predložio sam postupak određivanja retrovirusnog titra spektrofotometrijski (uz obaveznu korekciju na raspršenje) ili kvantitativnim RT-PCR-om te korištenje PCR-a pri određivanju optimalnih uvjeta transfekcije stanica za produkciju retrovirusa. Ti postupci nisu značajni u rutinskoj primjeni spomenute tehnike uspostave trajnih kultura ali znatno olakšavaju i ubrzavaju postupak njenog uvođenja i određivanja optimalnih uvjeta po prvi put

hTERT; Phoenix; retroviralni vektori; transfekcija

nije evidentirano