njemački

Učinak transgena za fenilalanin-amonij-lijazu na sintezu ružmarinske kiseline u kulturi tkiva ukrasne koprive (Coleus blumei Benth.)

U biosintezi ružmarinske kiseline (RA) sudjeluje osam enzima. Prvi korak biosinteze, deaminacija L-fenilalanina u t-cimetnu kiselinu, katalizira enzim fenilalanin-amonij-lijaza (PAL, EC 4.3.1.5). Glavna kontrolna točka regulacije aktivnosti PAL-a je na razini poticanja transkripcije. U staničnoj kulturi ukrasne koprive pojačnoj sintezi RA prethodi pojačana aktivnost fenilalanin-amonij-lijaze. Učinak pojačane ekspresije enzima PAL na nakupljanje RA bio je istražen u transgenom korijenju ukrasne koprive transformiranom s genom PAL1 iz uročnjaka Arabidopsis thaliana. Konstruirani su binarni plazmidi pGPTV-PAL1 i pGPTV-K. Plazmid pGPTV-PAL1 na T-DNA pored gena PAL1 pod kontrolom promotora CaMV 35S ima gen bar kontroliran promotorom p nos. Gen bar transformiranim biljnim stanicama omogućavao je rast na hranjivoj podlozi s dodatkom amonij glufozinata (GLA). Plazmid pGPTV-K nizvodno od promotora p nos imao je gen bar, zatim promotor CaMV 35S, bez gena PAL1. Plazmidima pGPTV (nizvodno od promotora CaMV 35S ima gen za zeleno fluorescirajući protein), pGPTV-PAL1 i pGPTV-K transformirane su bakterije Agrobacterium tumefaciens C58C1 (GV3101/pMP90). Agrobakterije s plazmidima poslužile su kao vektori za transformaciju lisnih eksplantata ukrasne koprive. Indukcija transgenog korijenja postignuta je na hranjivoj podlozi MS s dodatkom 1 mg/l α -naftalen-octene kiseline (NAA) i 1 mg/l GLA. Za eliminaciju agrobakterija u podlogu je dodano 250 mg/l cefotaksima, 100 mg/l vankomicina i 1 ml/l PPM-a. Selekcija transgenog korijenja provedena je na hranjivoj podlozi MS s dodatkom 0, 2 mg/l GLA te uz 0, 2 mg/l indolil-3-octene kiseline, 250 mg/l cefotaksima i 100 mg/l vankomicina. Korijenje je uzgajanao na podlozi MS s dodatkom 1 mg/l NAA. Uočena je prirodna, jaka, zelena i žuto zelena fluorescencija korijenskog tkiva koja je onemogućavala određivanje učinkovitosti transformacije zeleno fluorescirajućim proteinom. Selekcionirano je 13 korijenskih linija s transgenom PAL1 i 7 kontrolnih transgenih linija (transformiranih s plazmidom pGPTV-K). Aktivnost enzima PAL i sadržaj RA određeni su u tkivu uzgajanom na 24 °C i 20 °C. Na 24 °C sve transgene linije imale su aktivnost PAL-a veću od normalnog korijenja. Najveća aktivnost PAL-a bila je 348, 8 pkat/mg, što je 5, 6 puta više nego u normalnom korijenju. Osam linija s transgenom PAL1 nakupljalo je značajno veće količine RA od normalnog korijenja. Linije s transgenom PAL1 nakupljale su do 2, 75% RA što je 50% više od RA nakupljene u normalnom korijenju. Povećana aktivnost enzima PAL u većini linija uzrokovala je povećano nakupljanje RA. Jedna transgena linija nakupljala je 30% manje RA od normalnog korijenja, a pojačano je nakupljala klorogensku kiselinu. Na 20 °C šest linija s transgenom PAL1 imalo je aktivnost PAL-a značajno povišenu od normalnog korijenja. Najveća aktivnost PAL-a iznosila je 143, 4 pkat/mg što je 3, 7 puta više nego u normalnom korijenju. Snižavanjem temperature uzgoja s 24 °C na 20 °C sadržaj RA u linijama s transgenom PAL1 se smanjio, a u normalnom i kontrolnom transgenom korijenju porasao. Linije koje su imale najveću aktivnost PAL-a nakupljale su najmanje RA. U tim linijama bio je povećan sadržaj klorogenske kiseline.

Coleus blumei Benth.; ružmarinska kiselina; fenilalanin-amonij-lijaza; Agrobacterium; transformacija; pojačana ekspresija

nije evidentirano