hrvatski

Imunobiologija citomegalovirusnih proteina kao liganada za aktivacijske receptore na NK-stanicama

Cilj istraživanja: Ispitati biološki značaj gena m157 mišjeg citomegalovirusa (MCMV) u nadzoru MCMV-infekcije posredovanom NK-stanicama u Ly49H+ i Ly49H- sojeva miševa. Materijal i metode: Rekombinantni MCMV u kojem je uklonjen gen m157 te njegov odgovorajući revertantni virus u kojem je na ektopično mjesto u genomu vraćen gen m157 testirali smo u različitim Ly49H- i Ly49H+ sojevima miševa. Također smo koristili rekombinante MCMV-a u kojima je uklonjeno više imunoregulacijskih gena. Miševe smo injicirali intravenski ili intraperitonealno s virusima u dozi od 2 x 105 infektivnih čestica virusa (engl. plaque forming unit, PFU) za MCMV-osjetljive miševe odnosno u dozi od 5 x 105 PFU za MCMV-otporne miševe. Dan prije infekcije miševima smo uklonili NK-stanice ili smo ih ostavili netretirane te ih žrtvovali 3-4 dana nakon infekcije. Pratili smo aktivaciju Ly49H+ NK-stanica na način da smo protočnom citometrijom određivali razinu interferona gama (IFN- ) u njima. Protočnom citometrijom smo pomoću tetramera NKG2D-PE te protutijela specifičnih za pojedine NKG2D ligande pratili njihovo ispoljavanje na membrani inficiranih mišjih embrionalnih fibroblasta (MEF). Rezultati: Tijekom ranog razdoblja MCMV-infekcije sojevi laboratorijskih miševa mogu biti osjetljivi ili otporni na infekciju što je određeno lokusom Cmv1r tj. genom Ly49h koji određuje aktivacijski receptor NK-stanica, Ly49H. Ligand za ovaj receptor je protein m157, određen genom m157 MCMV-a. Infekcija Ly49H+ miševa virusom u kojem je uklonjen gen m157 dovodi do povećane virulencije takvog virusa u usporedbi s divljim tipom MCMV-a ili revertantnim virusom. Nadalje, uklanjanje NK-stanica nema učinka na titar delecijske mutante tj. ovaj se virus u Ly49H+ miševa ponaša poput divljeg tipa virusa u Ly49H- miševa. Uklanjanjem Ly49H+ NK-stanica te infekcijom novookoćenih miševa ili miševa kojima nedstaje receptor Ly49H (miševi BXD-8) pokazali smo da su ove stanice ključne u nadzoru MCMV-infekcije. Također smo pokazali da je međudjelovanje proteina m157 i receptora Ly49H u nadzoru MCMV-infekcije ključno u slezeni i plućima, ali ne u i jetri inficiranih životinja. Miševi 129/Svj ne posjeduju aktivacijski receptor Ly49H, ali njihove NK-stanice ispoljavaju inhibicijski receptor Ly49I koji može vezati protein m157. Miševi BALB/c također posjeduju receptor Ly49I, ali on u ovih miševa nije u stanju vezati protein m157. Slaba atenuacija delecijske mutante za gen m157 bila je prisutna u oba soja miševa što upućuje na to da međudjelovanje proteina m157 i receptora Ly49I nema značajnu ulogu u inhibiciji NK-stanica in vivo. Uporaba delecijske mutante za gen m157 dala nam je priliku izučavanja značaja i drugih gena MCMV-a koji su važni u izbjegavanju NK-posredovanog nadzora MCMV-infekcije. U istraživanjima gena MCMV-a odgovornih za otpornost divljih miševa soja PWK/Pas na infekciju koristili smo delecijske mutante MCMV-a za jedan ili dva gena unutar regije  6 (m145-m158) kojima smo inficirali miševe PWK/Pas x BALB/C F1 generacije. Nažalost, niti jedna od testiranih mutanti MCMV-a nije se u ovih miševa ponašala slično delecijskoj mutanti za gen m157 u Ly49H+ miševa. Nadalje, infekcija stanica MEF-a porijeklom iz ovih životinja divljim tipom MCMV-a pokazala je da virus u potpunosti negativno regulira ligande za aktivacijski receptor NKG2D što upućuje na to da je neki drugi mehanizam, a ne aktivacija NK-stanica putem NKG2D-a, odgovoran za otpornost ovih miševa na MCMV-infekciju. U ovome smo radu također pokazali da je nadzor MCMV-infekcije posredovan prirođenom imunošću u miševa na C57BL/6 genskoj pozadini nedostatan u slučaju da domaćin ne posjeduje mehanizme stečene imunosti. Nakon samo jedne pasaže MCMV-a kroz imunodeficitne Ly49H+ miševe dolazi do pojave MCMV mutanti za gen m157 koje su sposobne izbjeći prepoznavanje od strane NK-stanica. Zaključak: Ovim radom je po prvi puta pokazano da je protein m157 jedini protein MCMV-a koji služi kao ligand za aktivacijski receptor Ly49H te da međudjelovanje proteina m157 i inhibicijskog receptora Ly49I nije važno u nadzoru MCMV-infekcije in vivo. Nadalje, pokazali smo da pod snažnim selekcijskim tlakom od strane Ly49H+ NK-stanica, MCMV aktivno mutira gen m157 i na taj način izbjegava NK-posredovani nadzor infekcije.

Citomegalovirus; gen m157; imunološki nadzor; izbjegavanje; imunost; prirođena; NK-stanice; receptor Ly49H

nije evidentirano