hrvatski

Određivanje najpovoljnije metode za pripremu sperme bikova prilikom oplodnje in vitro

U suradnji klinike za porodništvo i reprodukciju Veterinarskog fakulteta i Centra za reprodukciju u stočarstvu Hrvatske d.o.o. utemeljen je standardni protokol za proizvodnju goveđih zametaka in vitro. U in vitro oplodnji goveda uobičajena je praksa da se koristi sjeme bikova sa dokazano visokim fertilitetom pri umjetnom osjemenjivanju. Moguće su situacije kada bikovi visoke genetske vrijednosti imaju ejakulate slabe kvalitete ( posljedica traume), a u IVF možemo iskoristiti veliki broj oocita s relativno malo spermija što bi bilo moguće rješenje za ovakve situacije. Moramo naglasiti da uzroci slabije kvalitete spermija ne smiju biti nasljedni. U ovom radu koristili smo grupu bikova koju smo odabrali na temelju NR ( koji je bio veći od 55 % ) u šest godina ( 1995.- 2000. godine ). Odabrali smo grupu od 9 bikova od kojih neki nisu živi, ali imamo dovoljno DS sjemena. Ejakulati su uzimani pomoću umjetne vagine, zatim slijedi ocjena ejakulata makroskopski i mikroskopski te smrzavanje i pohranjivanje u tekućem dušiku na – 196 &ordm ; C. Koristili smo DS sjeme koje smo otopili na +39&ordm ; C kroz 60 sekundi. Nakon toga procijenili smo: 1. pokretljivost sperme ( subjektivnom procijeom fazno-kontrastnim mikroskopom ) 2. koncentraciju brojanjem na komorici po Thomu 3. integritet membrane ( HOS test, eozin-nigrozin test ) 4. status akrosome ( Trypan blue-Giemsa ) Da bi odabrali najpogodniju metodu za pripremu sperme za IVF odabrali smo grupu od četiri bika ( Mundial, Hero, Zimbal, Lol ) te koristili metode Percoll, Swim up i ispiranje/centrifugiranje. Od svake metode napravili smo 3-4 ponavljanja. Nakon završenog postupka pripreme sperme ponovo smo odredili pokretljivost i koncentraciju. Rezultate koje smo dobili prikazali smo u tablici br. 6. Po rezultatima najbolja se pokazala metoda Percoll kako bi isključili utjecaj pojedinih bikova na rezultate koristili smo samo jednog bika ( Mundiala ). Otopili smo po tri pajete duboko smrznutog sjemena tog bika, napravili mješavinu i radili usporedno sve tri metode pripreme sperme, Nakon toga izvršili smo oplodnju već pripremLjenih jajnih stanica koje smo pratili do desetog dana. Ove rezultate prikazali smo u tablicama 7, 8 i 9, i usporedili ssve metode u tablici br.10 gdje smo još iskazali i rezultate integriteta membrana te akrosome spermija. Deseti dan nakon oplodnje dobili smo sa sve tri metode pripreme sperme za IVF podjednako dobre rezultate. Za daljnji rad odlučili smo se za metodu Percoll koja se pokazala kao najpogodnija za IVF. Koristili smo 9 bikova te napravili po tri ponavljanja. Ujedno smo i gledali integritet membrane ( HOS test ) i integritet akrosome ( Trypan blue test ) i to nakon odmrzavanja sperme i nakon postupka Percolla. Zatim smo izvršili oplodnju jajnih stanica i pratili brazdanje do desetog dana. Ukupno smo oplodili 1244 jajne stanice, brazdanje smo imali kod 820 jajnih stanica a deseti dan hBl je bilo kod 107 jajnih stanica ili 9, 41 %. Kod ispitivanih metoda nismo našli signifikantne razlike, no razlike postoje između bikova. Bikovi koji nisu imali baš najbolju pokretljivost pokazali su dobre rezultate prilikom in vitro oplodnje ( bik Pampas ), ili obrnuto, bik ( Hantal ) s vrlo dobrom pokretljivošću imao je slabiju oplodnju. Dobiveni rezultati ukazuju na potrebu daljnjeg usavršavanja metode za uspješnu oplodnju. Korišteni bikovi ovim su radom dobili još jedan pokazatelj svoje kvalitete.

bik; sperma; oplodnja in vitro; swim-up; Percoll; ispiranje/centrifugiranje

nije evidentirano