engleski

Cell transfection and the use of Green fluorescent protein (Methodological courses in biology and medicine)

Do danas je razvijeno niz metoda za prijenos DNA u eukariotske stanice (transfekcija), u cilju istraživanja regulacije gena ili pak posljedica njihove ekspresije. Ove metode uključuju upotrebu kalcij fosfata ili drugih divalentnih kationa, polikationa, liposoma, mikroinjekciju i elektroporaciju. Cilj ove metode je pokazati upotrebu LIPOFEKTAMINA (liposomska formulacija) u transfekciji kulture stanica. Ova metoda može se koristiti za prolaznu transfekciju, ali i za dobivanje stabilnih transfektanata. Pokazat će se dvije metode detekcije stanica koje su primile transfecirani plazmid. Detekcija fluorescencijom Zeleni fluorescentni protein (green fluorescent protein, GFP) upotrebljava se prvenstveno za detekciju smještaja proteina od interesa u stanici. cDNA ispitivanog gena subklonira se u vektor koji sadrži gen za zeleni fluorescentni protein, te se tako dobije fuzijski gen koji nakon transfekcije u stanici pokazuje zeleno obojenje. Transfekcija se može vršiti na različite načine (klasično, kalcij-fosfatom, lipofekcijom, elektroporacijom… ). Stanice se analiziraju upotrebom fluorescentne mikroskopije. U sklopu tečaja transfecirat ćemo stanice tumora glave i vrata uz pomoć Lipofectamine Plus reagensa s pEGFP konstruktom u koji je subkloniran gen nm23. Dvadeset četiri sata nakon transfekcije analizirat ćemo smještaj proteina uz pomoć fluorescentne mikroskopije. Pored određivanja smještaja proteina u stanici zeleni fluorescentni protein rutinski se koristi i za određivanje efikasnosti transfekcije, a pojedine varijante mogu se koristiti i za mjerenje efikasnosti promotora, obilježavanje staničnih organela, u protočnoj citometriji i sl.

GFP; transfection

nije evidentirano