hrvatski

Dobivanje rekombinantnih proteina suvremenim ekspresijskim sustavima: primjer kvaščeve seril-tRNA-sintetaze

Cilj ovog rada bio je dobiti kvaščevu seril-tRNA-sintetazu s delecijom baznog produžetka od 20 aminokiselina na C-kraju, kao i enzim divljeg tipa radi komparativnih istraživanja. U tu svrhu konstruirani su kvaščevi i bakterijski ekspresijski vektori koji su sadržavali gene SES1 ili SES1Δ C20 pod kontrolom različitih promotora. Korišteni ekspresijski vektori omogućavali su nastanak fuzije (His6 ili His6-GST) na N-kraju rekombinantnog proteina, koja je imala važnu ulogu u pročišćavanju, kao i detekciji proteina Western analizom. Krnja kvaščeva seril-tRNA-sinztetaza s His6 i His6-GST afinitetnim fuzijama ekspimirana je u kvascu indukcijom s GAL promotora s pYES260 i pYES263 konstrukata, ali je razina ekspresije bila tek nešto veća od one endogenog kvaščevog enzima. Zbog male razine ekspresije i prisutnosti endogenog kvaščevog enzim koji bi otežavao pročišćavanje, promijenjen je ekspresijski sustav. Krnja kvaščeva seril-tRNA-sintetaza s His6 afinitetnim privjeskom eksprimirana je u E. coli. Postignuta je vrlo visoka razina ekspresije, ali je većina proteina završila u inkluzijskim tijelima. Problem inkluzijskih tijela pokušano je riješiti upotrebom različitih vektora, te varijacijom medija i temperature indukcije, ali bez pozitivnih pomaka. Topljivi dio SerRSΔ C20 u staničnom ekstraktu pročišćen je u jednom koraku afinitetnom kromatografijom na Ni-NTA agarozi, te u dva koraka taloženjem amonijavim sulfatom i kromatografijom na ionskim izmjenjivačima stupca FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) sustava, kao u tri koraka kromatografijom na DEAE celulozi i stupcima FPLC sustava. Nakon pročišćavanja svim navedenim metodama rekombinantni protein bio je katalitički neaktivan.

afinitetna kromatografija; aminoacil-tRNA-sintetaza; Escherichia coli; inkluzijska tijela; pročišćavanje proteina; Saccharomyces cerevisiae; seril-tRNA-sintetaza

nije evidentirano