hrvatski

Pročišćavanje i karakterizacija alkalne fosfataze iz bakterije E. coli

Alkalna fosfataza je enzim prisutan u većini živih organizama, a ima ulogu katalizatora hidrolize organskih fosfomonoestera, fosforotioata, fosforoamidata i tiofosfata. ALP je dimerni metaloprotein kojeg čine dvije podjedinice s odvojenim aktivnim centrima, u kojima su smještena dva atoma cinka i atom magnezija, odgovorni za katalitičku aktivnost. Zbog odstupanja od Michaelis-Menten kinetike, koja su uočena u radu s ALP, predložen je novi model katalitičkog ciklusa kojim se ALP prikazuje kao asimetričan enzim s različitim afinitetom podjedinica prema supstratu i Pi. Posljedica različitog afiniteta je olakšano otpuštanje produkata reakcije, a vezanje magnezija može ubrzati izmjenu konformacije podjedinica. Maksimalnu aktivnost ALP postiže u alkalnom području. ALP u soju E15 bakterije Escherichia coli kodirana je phoA genom koji je dio pho regulona, a smješten je na kromosomu. Kako je u soju E15 bakterije E. coli gen za ALP deletiran, bakterija je transformirana plazmidom pET11d u koji je prethodno ukloniran gen za ALP. Manjak fosfata u stanici inducira transkripciju phoA gena, čiji je krajnji produkt nakon modifikacije na citoplazmatskoj membrani i u periplazmatskom prostoru ALP. U ovom radu uzgojena je kultura bakterijskih stanica E. coli u kojima je inducirana sinteza ALP, nakon čega je enzim izoliran i pročišćen ion-izmjenjivačkom kromatografijom. Pročišćavanje se temelji na reverzibilnoj interakciji nabijenog proteina i suprotno nabijenog medija kolone, pri čemu se ciljni proteini koncentriraju, a potom se ispiru i sakupljaju u pročišćenom obliku. U svrhu određivanja koncentracije dobivenog uzorka korištene su dvije metode ; metoda po Bradfordu i UV metoda. Uzorci iz različitih faza izoliranja i pročišćavanja naneseni su na SDS-poliakrilamidni gel kako bi se elektroforezom provjerila čistoća pojedinih uzoraka u odnosu na standard. U toku pročišćavanja mjerena je aktivnost enzima, kako bi se utvrdilo koje frakcije su količinski najbogatije enzimom. Aktivnost enzima mjeri se praćenjem promjene absorbancije p-nitrofenola koji je jedan od produkata enzimski katalizirane reakcije hidrolize p-nitrofenil fosfata. Neke frakcije uzoraka dobivene ion-izmjenjivačkom kromatografijom, pomiješane su u novi uzorak koji je nanesen na hidrofobnu interakcijsku kolonu radi daljnjeg pročišćavanja. Kako je došlo do razrijeđenja uzorka koji je bio dovoljno čist i prije HIC, ta se metoda nije dalje koristila. Frakcije enzima dobivene ion-izmjenjivačkom kromatografijom pomiješane su, a uzorak je korišten u daljnjem radu za mjerenje kinetičkih svojstava i praćenje stabilnosti enzima. Kinetička svojstva mjerena su u 1 M Tris, pH 8, 0, bez inhibitora, i u 1 M Tris, pH 8, 0, koji sadrži anorganski fosfat kao inhibitor (0, 025 mM Pi ). Kinetička svojstva mjerena su i u 0, 35 M 2A2M1P puferu, pH 10, 5, bez inhibitora, i u 0, 35 M 2A2M1P puferu, pH 10, 5, koji sadrži anorganski fosfat kao inhibitor (0, 05 mM Pi). Dobivene kinetičke konstante ukazuju na to da se radi o inhibiciji kompetitivnim inhibitorom. Enzim je izrazito stabilan i otporan na denaturaciju što su dokazali rezultati praćenja stabilnosti enzima nakon inkubacije u 9 M urei. Također je dokazano da se enzim kroz kratko vrijeme inkubacije jako brzo inaktivira u otopini s 0, 1 mM EDTA, koja narušava strukturu aktivnog centra kompleksiranjem iona metala. Stabilnost enzima određena je u 0, 35 M 2A2M1P puferu, pH 10, 5, sa i bez iona metala. Enzim se brže inaktivira u 2A2M1P puferu bez iona metala, a prisutnost supstrata usporava inaktivaciju i djelomično reaktivira enzim inkubiran u 2A2M1P puferu bez supstrata.

alkalna fosfataza; enzimska kinetika; kromatografija

nije evidentirano