hrvatski

Inaktivacija gena slr0192 cijanobakterije Synechocystis sp. PCC6803

Smatra se da su cijanobakterije predci k1oroplasta te se zbog toga na njima provode brojna straživanja. Iako je čitav genom cijanobakerije Synechocystis sekvencioniran, funkcija nnogih gena još je neistražena. Proučavanjem k1oroplasta kao i procesa fotosinteze kod biljke Arabidopsis thaliana pronaden je protein TROL za kojega se vjeruje da ima ulogu u regulaciji fotosinteze. Uspoređivanjem genoma cijanobakterije Synechocystis s genomskim slijedom biljke A. thaliana pronađen je homolog TROL-a, gen slrO192 za kojega se vjeruje da je potencijalna rodanaza. Da bi se ispitala njegova funkcija, primjenjena je metoda insercijske inaktivacije kojom bi se utišao taj gen što bi moglo pokazati koja je njegova uloga u cijanobakterija. Insercijskom inaktivacijom postiže se homologna rekombinacija izmedu plazmida i ciljanog gena. Cilj ovog rada bila je konstrukcija genetičke kazete kojom bi se utišao gen slrO192 cijanobakterije Synechocystis sp. PCC6803. Da bi se ta kazeta složila, provedena je lančana reakcija polimeraze za koju je korištena DNA izolirana iz cijanobakterije kao kalup i oligonuk1eotidne klice. Dobivena su dva PCR-produkta koja su zatim klonirana u T -vektor. Uspješnost kloniranja potvrdena je alfa-komplementacijom, odnosno metodom obojene selekcije kao i restrikcijskim endonukleazama EcoRI i BamHI u slučaju kloniranja lijevog PCR-produkta te BamHI i XbaI u slučaju kloniranja desnog PCR-produkta. Nakon toga su PCR-produkti izolirani iz T-vektora i klonirani u vektor pBluescript što je takoder potvrdeno restrikcijom s istim enzimima. Tim kloniranjem je umjetno stvoreno BamHI mjesto kojeg nema u određenom slijedu DNA. Zadnji korak slaganja konstrukta bio je ligiranje kanamicinske kazete u vektor pBluescript. Kanamicinska kazeta najprije je izolirana iz vektora pUC4K, a zatim klonirana u umjetno stvoreno BamHI mjesto u vektoru pBluescript. Uspješnost ovog kloniranja potvrđena je rastom bakterija na kanamicinskim pločama kao i restrikcijom s enzimom HindIII čije se mjesto nalazi u kanamicinskoj kazeti. Ona se u vektor ugradila u dvije orijentacije, "foward" i "reverse". Time je konstrukt za inaktivaciju gena slrO192 cijanobakterije Synechocystis bio završen i spreman za transformaciju.

Fotosinteza ; Rodanaza ; Kanamicinska rezistencija ; Homologna rekombinacija

nije evidentirano