hrvatski

Real-time PCR (Metodološki tečajevi u biologiji i medicini)

Klasična metoda RT-PCR (reverse transcriptase PCR) je semikvantitativna, stoga je potreba za preciznijom kvantifikacijom mRNA dovela do razvoja nove tehnike nazvane real time PCR. Real time PCR je pouzdana i precizna metoda za kvantifikaciju specifičnih molekula DNA. Za reakciju su potrebne vrlo male količine mRNA što omogućava upotrebu ove metode u slučajevima kada na raspolaganju imamo vrlo male količine tkiva (mikrodisekcija). Produkti lančane reakcije polimeraze obilježeni fluorescencijskom bojom (PCR, polymerase chain reaction) kontinuirano se analiziraju. Fluorescencijska boja (najčešće se koristi SYBR Green I) vezana je uz prigušivač (Q- quencher) a emitira fluorescenciju tek nakon razdvajanja od njega, tj. vezanjem za dvolančanu (novonastalu) DNA. Dakle, mjerenjem fluorescencije mjerimo nastalu DNA jer količina fluorescencije razmjerna je količini PCR proizvoda. Nakon završene reakcije PCR, aparat se može programirati da načini krivulju taljenja, u kojoj se mjeri fluorescencija u odnosu na temperaturu. Tako real-time PCR određuje i točku taljenja (melting point) novonastalog proizvoda, kada se dva lanca DNA odvoje i fluorescencija naglo prestaje. Ovim provjeravamo specifičnost produkta, jer svi produkti za specifičan par primera moraju imati istu krivulju taljenja (melting curve). Danas se u praksi sve više koristi Taqman kemija u reakciji real-time PCR-a. Metoda se zasniva na korištenju neobilježenih specifičnih početnih oligonukleotida te specifične obilježene probe. Ova metoda koristi se kako u analizi ekspresije gena tako i u SNP analizi u kojoj se koriste dvije specifične i različito obilježene probe. Real-time PCR koristi se za apsolutnu ili relativnu kvantifikaciju DNA/RNA. Apsolutnom kvantifikacijom možemo precizno odrediti broj kopija RNA u nekom uzorku uspoređujući fluorescenciju s standardnom krivuljom. Relativnom pak kvantifikacijom možemo analizirati relativne promjene u količini transkripta. Real-time PCR sve veću primjenu nalazi u SNP analizi. SNP analiza koristi se u molekularnoj genetici u testiranju rizika za oboljevanje od određene bolesti te u testiranju mogućeg odgovora na terapiju u pojedinca (personalna medicina).

Real-time PCR

nije evidentirano