hrvatski

Optimizacija visokoprotočne metode za analizu N- glikozilacije alfa-1 kiselog glikoproteina

Alfa-1 kiseli glikoprotein (AGP) izrazito je glikoziliran serumski protein akutne faze koji sadrži pet vezanih N-glikana kompleksnog tipa na polipeptidnoj okosnici. Promjene u glikozilaciji AGP-a prisutne u raznim fiziološkim i patofiziološkim stanjima. Nedavno je razvijena nova ekonomski isplativa visokoprotočna metoda koja omogućuje precizno i sveobuhvatno određivanje N-glikanskog profila AGP-a iz malog volumena krvnog seruma ili plazme. Navedenom metodom pokazalo se da je N-glikanski profil stabilan kod zdravih pojedinaca, a promjene u njegovoj N- glikozilaciji bi mogle poslužiti kao novi biomarker u prepoznavanju osoba s povećanim rizikom za razvoj diabetes mellitusa tipa II. AGP se obogaćuje iz uzorka precipitacijom seromukoidne frakcije nakon koje slijedi redukcija, alkilacija i tripsinizacija te daljnje obogaćivanje glikopeptida pomoću ekstrakcije na čvrstoj fazi (HILIC-SPE). Dobiveni glikopeptidi analiziraju se obrnuto faznom kromatografijom spregnutom s masenim spektrometrom čime se dobiva detaljan uvid u glikanski profil svakog N- glikozilacijskog mjesta AGP-a. Prilikom provođenja metode na velikom broju uzoraka, kod nekih je primijećen smanjen intenzitet signala glikozilacijskog mjesta III. Kako bi se utvrdio uzrok navedenog odstupanja ispitan je utjecaj koncentracije tripsina i udjela ACN-a u mobilnoj fazi HILIC-SPE na intenzitet glikozilacijskog mjesta III. Utjecaj tripsina je ispitan zbog otpornosti AGP-a na tripsinizaciju, dok je povećanje udjela ACN-a u mobilnoj fazi razmotreno zbog velikog udjela hidrofobnog peptidnog djela koji bi mogao smanjiti afinitet prema polarnoj stacionarnoj fazi prilikom obogaćivanja ekstrakcijom na čvrstoj fazi. Promjena koncentracije tripsina nije utjecala na intenzitet signala, dok je povećanje udjela ACN-a u koraku obogaćivanja pojačalo intenzitet signala glikozilacijskog mjesta od interesa. Ove promjene u protokolu (osim prilikom korištenja pet puta veće koncentracije tripsina od standardne) smanjile su preciznost u odnosu na standardnu metodu, što u konačnici nije pogodno za optimizaciju metode. U budućem radu potrebno je ispitati druge stacionarne faze koje bi bile prikladne za korištenje prilikom HILIC-SPE ili neke druge metode obogaćivanja koje bi osim povećanje intenziteta signala glikozilacijskog mjesta III zadovoljile uvjete preciznosti metode u odnosu na standardni postupak.

alfa-1 kiseli glikoprotein ; N-glikozilacija ; HILIC-SPE ; LC-MS ; optimizacija

nije evidentirano