hrvatski

Genotipizacija JAK2 V617F u uzorcima cirkulirajuće tumorske DNA dobivenim tekućom biopsijom pacijenata s kolorektalnim karcinomom

Tekuća biopsija omogućava nov neinvazivan pristup u molekularnom profiliranju tumora uključujući kolorektalni karcinom (CRC). Cirkulirajuća tumorska DNA (ctDNA) jedan je od obećavajućih biomarkera za probir, praćenje odgovora na terapiju, procjenu progresije i ishoda bolesti. Kako je rukovanje uzorcima tekuće biopsije zahtjevno, a nije standardizirano, prikazana je optimizacija metode za genotipizaciju JAK2 V617F u uzorcima ctDNA dobivenih tekućom biopsijom pacijenata s CRC-om. U sklopu projekta HRZZ IP- 2019-04-4624 prikupljena je periferna venska krv u epruvete CellSave (Menarini Silicon Biosistems) pri +4 °C od 25 pacijenata s CRC te je isti dan odvojena plazma i pohranjena na –20 °C. ctDNA je izdvojena u duplikatu iz 1–1, 5 mL plazme pomoću kompleta QIAamp ccfDNA/RNA Kit (Qiagen). Koncentracije ctDNA određene su fluorimetrijski pomoću uređaja DS-11 FX (DeNovix) i reagensa Qubit dsDNA HS Assay (Thermo Fisher Scientific). Genotipizacija JAK2 V617F u uzorcima ctDNA provedena je na uređaju 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) metodom alelne diskriminacije nakon lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu (qPCR) uz komplet početnica i sondi TaqMan Digital PCR Liquid Biopsy Assay (Applied Biosystems) i uz dva isprobana reagensa za umnažanje TaqMan Genotyping PCR Master Mix i TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Kao kontrolni uzorci korišteni su uzorci genomske DNA iz leukocita genotipizirani akreditiranom metodom. Utvrđene su koncentracije ctDNA u rasponu od 0, 002 do 0, 993 ng/μL. Početno ispitivanje umnažanja i uspješnosti genotipizacije dalo je zadovoljavajuće rezultate za kontrolne uzorke ; vidljivo je umnažanje do 30. ciklusa, a očekivana diskriminacija alela nakon 40 ciklusa umnažanja bez obzira na korišteni reagens. Za uzorke ctDNA nije dobiveno uspješno umnažanje pa je ono nastavljeno tijekom još 20 ciklusa. Nakon 60 ciklusa umnažanja uspješno je očitan rezultat genotipizacije u uzorcima ctDNA umnoženih pomoću TaqMan Universal PCR Master Mix-a, dok reagens TaqMan Genotyping PCR Master Mix i dalje nije dao zadovoljavajuće umnažanje. Opisanom metodom uspješno je provedena genotipizacija JAK2 V617F za 24 od 25 prikupljenih uzoraka ctDNA iz periferne krvi pacijenata s CRC- om, iako prisutnost mutacije nije utvrđena niti u jednom uzorku. Dobiveni rezultati usporedit će se s rezultatima genotipizacije DNA izdvojene iz tumorskog tkiva i tako pridonijeti daljnjem profiliranju CRC-a korištenjem tekuće biopsije.

cirkulirajuća tumorska DNA ; genotipizacija ; JAK2 ; kolorektalni karcinom ; tekuća biopsija

nije evidentirano