hrvatski

Granica detekcije SARS-CoV-2 metodom RT-qPCR po Berlinskom protokolu i komercijalnim kitom

Uvod: Cilj ovog istraživanja je bilo utvrđivanje granice detekcije odnosno Ct vrijednosti i broja kopija virusne RNA pomoću komercijalnog kontrolnog uzorka EURM-019 s poznatim brojem kopija kako bi se jasno mogli razlikovati pozitivni od negativnih rezultata SARS-CoV-2 metodom RT-qPCR te pouzdano izdavati rezultati testiranja. Materijali i metode: Komercijalni uzorak EURM- 019 s poznatim brojem kopija RNA od 107 kopija/ μL do 100 kopija/μL je korišten za potvrdu granice detekcije. Ukupno 54 uzorka brisa nazofarinksa pacijenata ; 29 očekivano pozitivnih i 25 očekivano negativnih uzoraka je analizirano prema određenoj granici detekcije. Izolacija virusne RNA napravljena je MagMAX Viral/Pathogen II Nucleic Acid Isolation Kit-om (Applied Biosystems) na uređaju za automatsku izolaciju nukleinskih kiselina KingFisher Flex (Applied Biosystems). Umnažanje SARS-CoV-2 je napravljeno na tri različite RT-PCR platforme: ABI7500 i QS5 (Applied Biosystems) i AriaMx (Agilent) Berlinskim protokolom detekcijom E i RdRp gena i komercijalnim kitom LiliF COVID-19 Real-time RT- PCR Kit detekcijom E, RdRp i N gena. Rezultati: Za određivanje granice detekcije, uz stopu detekcije veću od 95%, kao kriterij za pozitivan rezultat, postavljeno je da svi geni koji se mogu detektirati u PCR kitovima budu iznad praga osnovne fluorescencije s prisutnom krivuljom umnažanja. Utvrđena granice detekcije je bila 15 kopija/reakciji odnosno 3 kopije/μL i po Berlinskom protokolu i Lilifom, što je odgovaralo vrijednosti Ct 32 tj. Ct 31. Od 54 uzorka očekivano pozitivnih je bilo 29. Po postavljanju Ct < 32 tj. Ct < 31 po Berlinskom protokolu tj. Lilifu, 21 uzorak (21/29) je označen kao pozitivan rezultat za oba PCR kita, dok je 8 (8/29) uzoraka za oba kita bilo iznad Ct > 32 i rezultat je očitan kao negativan. Svi očekivano negativni uzorci bili su negativni. Zaključak: Postavljanje granice detekcije važno je za kvalitativne metode kao što je korištena RT-qPCR za razlikovanje SARS-CoV-2 pozitivnih od negativnih pacijenata te pouzdano izdavanje rezultata koji mogu smanjiti potrebu za re-testiranjem pacijenata.

SARS-CoV-2, Berlinski protokol, usporedba metoda

nije evidentirano

engleski

Limit of detection of SARS-CoV-2 using RT-qPCR according to Berlin protocol and commercial kit

Uvod: Cilj ovog istraživanja je bilo utvrđivanje granice detekcije odnosno Ct vrijednosti i broja kopija virusne RNA pomoću komercijalnog kontrolnog uzorka EURM-019 s poznatim brojem kopija kako bi se jasno mogli razlikovati pozitivni od negativnih rezultata SARS-CoV-2 metodom RT-qPCR te pouzdano izdavati rezultati testiranja. Materijali i metode: Komercijalni uzorak EURM- 019 s poznatim brojem kopija RNA od 107 kopija/ μL do 100 kopija/μL je korišten za potvrdu granice detekcije. Ukupno 54 uzorka brisa nazofarinksa pacijenata ; 29 očekivano pozitivnih i 25 očekivano negativnih uzoraka je analizirano prema određenoj granici detekcije. Izolacija virusne RNA napravljena je MagMAX Viral/Pathogen II Nucleic Acid Isolation Kit-om (Applied Biosystems) na uređaju za automatsku izolaciju nukleinskih kiselina KingFisher Flex (Applied Biosystems). Umnažanje SARS-CoV-2 je napravljeno na tri različite RT-PCR platforme: ABI7500 i QS5 (Applied Biosystems) i AriaMx (Agilent) Berlinskim protokolom detekcijom E i RdRp gena i komercijalnim kitom LiliF COVID-19 Real-time RT- PCR Kit detekcijom E, RdRp i N gena. Rezultati: Za određivanje granice detekcije, uz stopu detekcije veću od 95%, kao kriterij za pozitivan rezultat, postavljeno je da svi geni koji se mogu detektirati u PCR kitovima budu iznad praga osnovne fluorescencije s prisutnom krivuljom umnažanja. Utvrđena granice detekcije je bila 15 kopija/reakciji odnosno 3 kopije/μL i po Berlinskom protokolu i Lilifom, što je odgovaralo vrijednosti Ct 32 tj. Ct 31. Od 54 uzorka očekivano pozitivnih je bilo 29. Po postavljanju Ct < 32 tj. Ct < 31 po Berlinskom protokolu tj. Lilifu, 21 uzorak (21/29) je označen kao pozitivan rezultat za oba PCR kita, dok je 8 (8/29) uzoraka za oba kita bilo iznad Ct > 32 i rezultat je očitan kao negativan. Svi očekivano negativni uzorci bili su negativni. Zaključak: Postavljanje granice detekcije važno je za kvalitativne metode kao što je korištena RT-qPCR za razlikovanje SARS-CoV-2 pozitivnih od negativnih pacijenata te pouzdano izdavanje rezultata koji mogu smanjiti potrebu za re-testiranjem pacijenata.

SARS-CoV-2, Berlin protocol, method comparison

nije evidentirano