hrvatski

Uspostava metoda za izolaciju egzosoma iz plazme i njihovu karakterizaciju

Uvod: Egzosomi su izvanstanične vezikule promjera 30-150 nm, bogate proteinima, RNA molekulama i dijelovima genomske DNA. Egzosomi imaju važnu ulogu u dijagnostici tumorskih bolesti primjenom tekuće biopsije, ali nanometarska veličina otežava njihovu izolaciju i karakterizaciju. Cilj ovoga rada bio je uspostaviti metodu za izolaciju egzosoma iz plazme bolesnika s kolorektalnim karcinomom (CRC). Materijali i metode: Plazma je dobivena centrifugiranjem pune krvi 11 bolesnika s CRC-om. Izolacija egzosoma provedena je korištenjem dva komercijalno dostupna kompleta, miRCURY Exosome Serum/Plasma Kit (Qiagen, Njemačka) ili Invitrogen Total Exosome Isolation Kit (from plasma) (ThermoFisher Scientific, SAD). Egzosomi su lizirani RIPA puferom i sonikacijom. Koncentracija proteina utvrđena je kolorimetrijskom metodom s bicinkoniničnom kiselinom ili mjerenjem apsorbancije na 280 nm korištenjem DS-11 spektrofotometra (DeNovix, SAD). Uzorci egzosoma pripremljeni su za SDS-PAGE miješanjem s puferom za pripremu uzoraka (s ili bez β-merkaptoetanola). Karakterizacija je provedena Western blot metodom uz upotrebu mišjih monoklonskih antitijela za CD9, HSC70, aktin i kalneksin (Invitrogen, SAD). Rezultati: Određivanjem koncentracije proteina kolorimetrijskom metodom dobivena je zadovoljavajuća preciznost u seriji (7, 91 %), točnost (96, 53 %) i linearnost (r = 0, 9964), dok rezultati dobiveni mjerenjem apsorbancije na 280 nm nisu bili prihvatljivi zbog nemogućnosti otklanjanja interferencije RIPA pufera. Sveukupni rezultati volumena i broja egzosoma te određivanja koncentracije proteina u egzosomima i njihovim vizualnim očitanjem na gelu za SDS-PAGE razvidno je da Qiagenov komplet daje bolji prinos egzosoma od ThermoFisherovog kompleta. U svim je uzorcima egzosoma Western blotom dokazana prisutnost njihovog biljega CD9, uz nereducirajuće uvjete (bez β-merkaptoetanola). U pojedinim je uzorcima dobiven signal za HSC70, a niti u jednom uzroku nije dokazan aktin. Odsutnost endoplazmatskog retikula u uzorcima dokazana je izostankom vrpce karakteristične za kalneksin. Zaključak: Pokazano je da je za izolaciju egzosoma primjeren Qiagenov komplet, a za određivanje koncentracije proteina u uzorcima egzosoma s RIPA puferom kolorimetrijska metoda s bicinkoniničnom kiselinom.

egzosomi ; izolacija ; karakterizacija ; kolorektalni karcinom ; proteini

nije evidentirano

engleski

Evaluation of methods for isolation of exosomes from plasma and their characterisation

Uvod: Egzosomi su izvanstanične vezikule promjera 30-150 nm, bogate proteinima, RNA molekulama i dijelovima genomske DNA. Egzosomi imaju važnu ulogu u dijagnostici tumorskih bolesti primjenom tekuće biopsije, ali nanometarska veličina otežava njihovu izolaciju i karakterizaciju. Cilj ovoga rada bio je uspostaviti metodu za izolaciju egzosoma iz plazme bolesnika s kolorektalnim karcinomom (CRC). Materijali i metode: Plazma je dobivena centrifugiranjem pune krvi 11 bolesnika s CRC-om. Izolacija egzosoma provedena je korištenjem dva komercijalno dostupna kompleta, miRCURY Exosome Serum/Plasma Kit (Qiagen, Njemačka) ili Invitrogen Total Exosome Isolation Kit (from plasma) (ThermoFisher Scientific, SAD). Egzosomi su lizirani RIPA puferom i sonikacijom. Koncentracija proteina utvrđena je kolorimetrijskom metodom s bicinkoniničnom kiselinom ili mjerenjem apsorbancije na 280 nm korištenjem DS-11 spektrofotometra (DeNovix, SAD). Uzorci egzosoma pripremljeni su za SDS-PAGE miješanjem s puferom za pripremu uzoraka (s ili bez β-merkaptoetanola). Karakterizacija je provedena Western blot metodom uz upotrebu mišjih monoklonskih antitijela za CD9, HSC70, aktin i kalneksin (Invitrogen, SAD). Rezultati: Određivanjem koncentracije proteina kolorimetrijskom metodom dobivena je zadovoljavajuća preciznost u seriji (7, 91 %), točnost (96, 53 %) i linearnost (r = 0, 9964), dok rezultati dobiveni mjerenjem apsorbancije na 280 nm nisu bili prihvatljivi zbog nemogućnosti otklanjanja interferencije RIPA pufera. Sveukupni rezultati volumena i broja egzosoma te određivanja koncentracije proteina u egzosomima i njihovim vizualnim očitanjem na gelu za SDS-PAGE razvidno je da Qiagenov komplet daje bolji prinos egzosoma od ThermoFisherovog kompleta. U svim je uzorcima egzosoma Western blotom dokazana prisutnost njihovog biljega CD9, uz nereducirajuće uvjete (bez β-merkaptoetanola). U pojedinim je uzorcima dobiven signal za HSC70, a niti u jednom uzroku nije dokazan aktin. Odsutnost endoplazmatskog retikula u uzorcima dokazana je izostankom vrpce karakteristične za kalneksin. Zaključak: Pokazano je da je za izolaciju egzosoma primjeren Qiagenov komplet, a za određivanje koncentracije proteina u uzorcima egzosoma s RIPA puferom kolorimetrijska metoda s bicinkoniničnom kiselinom.

exosomes ; isolation ; characterization ; colorectal cancer ; proteins

nije evidentirano