hrvatski

Optimizacija izolacije zigotnih embrija uročnjaka (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) u svrhu istraživanja kvantitativne ekspresije gena

Analize genske ekspresije u pojedinim embrionalnim stadijima daju uvid u genetske mehanizme i regulatorne mreže koji omogućuju potpuni razvoj embrija. Zbog točno određenog i predvidljivog razvoja tijekom embriogeneze, uročnjak (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) je idealan model u takvim istraživanjima. Brojne tehničke poteškoće povezane s izolacijom različitih stadija zigotnih embrija otežavaju analize ekspresije gena tijekom embriogeneze. Ovim radom uhodane su lako primjenjive metode izolacije pojedinih stadija embrija uročnjaka koje omogućuju izdvajanje velikog broja čistih embrija, oslobođenih od stanica majčinske biljke koje u ovakvom tipu istraživanja predstavljaju kontaminaciju. Uhodan je postupak mikromanipulacije zigotnih embrija, upotrebom invertnog mikroskopa s mikrodisektorom, koji omogućuje izdvajanje nekoliko razvojnih stadija embrija. Na različitim transgeničnim i mutantnim linijama uročnjaka provedena je metoda izolacije dovoljne količine mRNA za analize ekspresije gena u kotiledonarnim embrijima. Metodom reverzne transkripcije mRNA su prepisane u cDNA koja je korištena kao kalup za umnažanje u kvantitativnoj lančanoj reakciji polimeraze (qPCR), te je analizirana relativna ekspresija gena CML41 i FBW2 u kotiledonarnim embrijima. Provedeno istraživanje ukazuje da je za analizu genske ekspresije do 6 gena metodom qPCR potrebno izolirati ukupnu mRNA iz 70-tak kotiledonarnih embrija. Metode izolacije embrija i mRNA provedene u ovom radu pomoći će u planiranju eksperimenata transkriptomske analize embrija u budućim istraživanjima.

Arabidopsis thaliana, izolacija embrija, mikromanipulacija, izolacija mRNA, qPCR

nije evidentirano