hrvatski

Kontrola ulaska jednolančane DNA u nukleazno aktivno mjesto proteina Cas3 pomoću 'triptofanskih vrata' u bakteriji Escherichia coli

Protein Cas3 je nukleaza-helikaza koja cijepa jednolančanu (ss) DNA i neophodna je u zadnjem koraku zaštite bakterija od napada stranom DNA obrambenim sustavom CRISPR-Cas. Kristalna struktura proteina Cas3 pokazala je da na putu do nukleaznog aktivnog mjesta jednolančana DNA mora proći kroz helikazne domene pri čemu su potrebne manje promjene u strukturi proteina. Iz genetičkih istraživanja uočili smo da se zaštita bakterija protiv napada fagima jako smanjila ako se temperatura povećala s 30 °C na 37 °C, da ovisi o proteinu Cas3 ali mehanizam je bio nepoznat. Da bi ga razjasnili, istraživali smo pročišćeni protein Cas3 i uočili da ima smanjenu nukleaznu aktivnost na povišenoj temperaturi koja se poklapala s mjerljivim promjenama u strukturi proteina i povećanim brojem plakova. Mutiranjem jednog visoko konzerviranog triptofana (Trp406) u alanin, nukleazna aktivnost proteina Cas3W406A više nije ovisila o temperaturi i mutirani protein je postao hiperaktivna nukleaza. Trp406 nalazi se na sučelju nukleazne HD i RecA1 helikazne domene koje su važne za usmjeravanje DNA u nukleazno aktivno mjesto. Simulacijama molekularne dinamike proteina Cas3 uočili smo da se pozicioniranje Trp406 mijenja ovisno o temperaturi, da blokira ili oslobađa put jednolančanoj DNA. Na temelju dobivenih rezultata, predlažemo da Trp406 tvori 'vrata' za kontrolu nukleazne aktivnosti proteina Cas3 te da učinak temperature ukazuje na moguću alosterijsku kontrolu nukleazne aktivnosti proteina Cas3. Osim prikazivanja rezultata, pokazat ću i sve prepreke i izazove na koje smo nailazili tijekom ovih istraživanja.

CRISPR-Cas ; Cas3 ; konformacija, E. coli

nije evidentirano