hrvatski

Nanopore sekvenciranje kukaca roda tribolium s tvrdim egzoskeletom

Napredak u području sekvenciranja genoma, a posebno razvoj tehnologije Nanopore, omogućili su u zadnje vrijeme uspješno sastavljanje složenih genoma i analizu regija bogatih ponavljanjima. Jedan od najvažniji čimbenika za uspješno sekvenciranje i slaganje genoma je izolacija visokomolekularne DNA, odnosno DNA velike prosječne duljine, prikladne čistoće u dovoljnoj količini. Izolacija DNA s takvim karakteristikama je zahtjevna prilikom primjene na tkivima, a postaje još zahtjevnija ukoliko je prisutan tvrdi egzoskelet kod kukaca. Također, komercijalno dostupni kompleti za izolaciju DNA često nisu testirani niti optimizirani za insekte. U tu svrhu, razvijena je reproducibilna metoda za izolaciju visokomolekularne DNA iz kukaca roda Tribolium te uporabu u sekvenciranju tehnologijom Nanopore. Ukratko, izolacijski protokol sastoji se od izolacije staničnih jezgri pomoću pufera optimiziranog za izolaciju jezgri sa što manjim gubicima te naknadnog pročišćavanja DNA na kromatografskoj koloni baziranoj na izmjeni aniona. Krajnji rezultat ovog postupka je visokomolekularna DNA odgovarajućih svojstava za pripremu DNA knjižnice koja se pokazala u dovoljnoj količini za više nanošenja na jednu MinION-pločicu za sekvenciranje, dajući do 13 Gb podataka. Utvrđeno je i da blago fragmentiranje DNA povećava prosječne vrijednosti N50očitanja do 26 kb te poboljšava životni vijek pora tijekom sekvenciranja. Iako je ovaj protokol testiran na kukcu T. castaneum i dvije blisko srodne vrste, opisani koraci u optimizaciji mogli bi biti korisni za primjenu na bilo kojem organizmu koji predstavlja izazov prilikom korištenja dostupnih konvencionalnih metoda za izolaciju DNA.

Tribolium ; Nanopore ; Sekvenciranje

nije evidentirano