hrvatski

HPLC metoda za ispitivanje kinetike enzimske metilacije 6-merkaptopurina

Tiopurin S-metiltransferaza (TPMT, E.C. 2.1.1.67) citosolni je enzim koji metilira sulfhidrilne skupine kako aromatskih, tako i heterocikličkih spojeva. Primjeri lijekova koje TPMT inaktivira su azatioprin, 6- merkaptopurin (6MP) i 6-tiogvanin koji se koriste kao imunosupresivi za liječenje leukemija, ali i upalnih bolesti crijeva. Cilj ovog istraživanja bio je razviti HPLC metodu za određivanje 6-metilmerkaptopurina (6MMP) kao metabolita 6-merkaptopurina u biološkom uzorku hemolizata kako bi se odredila enzimska kinetika, ali i postavili temelji za ispitivanje eventualnih interakcija biljnih dodataka prehrani sa lijekovima koji se metaboliziraju preko TPMT, a koje bi mogle dovesti do promjena u njihovim terapijskim koncentracijama. Krv korištena za istraživanje izvađena je zdravom dobrovoljcu na antikoagulant EDTA, eritrociti su odvojeni od krvne plazme, lizirani sa suviškom hladne ultračiste vode te skladišteni na -20 °C. Razvijena je HPLC metoda u trajanju od 22 min. Kao nepokretna faza korištena je Cortecs Phenyl kolona (150 × 4, 6 mm, veličina čestica 2, 7 um). Provedena je gradijentna eluacija s dvije sastavnice mobilne faze (0, 1 % mravlje kiseline u vodi, odnosno metanolu). Reakcijske otopine sadržavale su hemolizat, 6MP, S- adenozilmetionin (SAM, kofaktor u reakcijama metilacije), ditiotreitol i HClO4 pomoću koje je reakcija zaustavljana nakon inkubacije. Uzorci su inkubirani 90 minuta na 37 °C. Nakon utvrđivanja selektivnosti kao ključnog validacijskog parametra, ispitani su linearnost (r = 0, 9994), točnost (analitički prinosi između 97, 07 % i 98, 69 %) te preciznost (RSD = 0, 81 %, n = 6 ; analiza varijance pokazala je statistički neznačajnu razliku prinosa za α = 0, 05 kroz tri dana). Nadalje, ispitana je kinetika metilacije 6MP putem TPMT pri čemu kao produkt nastaje 6MMP. Vmax za 6MP iznosio je 41, 94 nmol 6MMP/h/g Hb, a Km 239, 5 µM. Vmax za SAM bio je 40, 93 nmol 6MMP/h/g Hb, a Km 7, 6 µM. Dobiveni rezultati poslužit će daljnjem ispitivanju mogućnosti interakcija biljnih dodataka prehrani i terapije azatioprinom ili 6MP. Ovaj rad je sufinancirala Hrvatska zaklada za znanost projektom [UIP-2017-05-3949].

6-merkaptopurin ; tiopurin metiltransferaza ; metilacija ; kinetika ; HPLC

nije evidentirano