nije evidentirano

Ispitivanje interakcija terpiridinskih kompleksa rutenijuma(II) sa transportnim proteinima seruma

Ova disertacija se bavi ispitivanjem interakcija tri potencijalna antitumorska kompleksa Ru(II) opšte formule mer-[Ru(Cl-tpy)(N-N)Cl]Cl (Cl-tpy - 4′- hloro2, 2′:6′, 2″-terpiridin ; N-N - 1, 2-diaminoetan (en), 1, 2-diaminocikloheksan (dach) ili 2, 2′- bipiridin (bipy)) sa transportnim proteinima seruma, humanim serum albuminom (HSA) i transferinom (Tf). Odabrani kompleksi Ru(II) pripadaju novoj klasi terpiridinskih kompleksa meridionalne geometrije, koji pokazuju visoku rastvorljivost u vodi. Do sada je u literaturi pokazana sposobnost ovih kompleksa da grade monofukcionalne adukte sa derivatima guanina, istiĉući njihov potencijal za vezivanje za DNK molekul. Međutim, interakcije sa proteinima do sada nisu ispitane. Kako se antikancerski agensi na bazi metala u organizam unose intravenozno, vezivanje kompleksa za transportne proteine seruma je izuzetno vaţno jer moţe značajno uticati na njihovu biodistribuciju i efikasnost. Rezultati su pokazali da se sva tri kompleksa vezuju za HSA i Tf, ali u različitoj meri (dach˃en˃˃bipy). U poređenju sa Tf, HSA pokazuje značajno veći vezivni kapacitet za sva tri kompleksa. Konstante vezivanja kompleksa sa en i dach ligandima su u slučaju HSA reda veličine 104 -105 M-1 , dok je vezivanje za Tf slabije, reda veličine 101 -102 M-1. Vrednosti konstanti vezivanja kompleksa sa bipy ligandom su zanemarljive i ukazuju na slabe interakcije. Vezivanje kompleksa nema značajnog uticaja na sekundarnu strukturu proteina, dok se na tercijarnoj strukturi uočavaju blage promene koje su izraženije kod Tf. Detaljnim ispitivanjem vezivnih mesta na Tf je pokazano da na proteinu postoji pet ostataka histidina za koje se kompleksi sa en i dach ligandima mogu vezati koordinativno kovalentno. Jedan od njih, His585, ulazi u sastav vezivnog mesta za gvožđe, dok su ostala mesta nespecifična i uključuju površinske ostatke histidina. Kompleks sa bipy ligandom se za Tf vezuje u maloj meri, najverovatnije preko nekovalentnih interakcija. U okviru vezivnih mesta na HSA, identifikovano je pet ostataka histidina i jedan ostatak asparaginske kiseline, za koje se kompleksi sa en i dach ligandima mogu vezati koordinativno kovalentno. Od toga, samo tri His i jedan Asp mogu biti mete za vezivanje kompleksa sa bipy ligandom. Prema doking studiji, ovi ostaci ulaze u sastav pet vezivnih mesta za en i dach, odnosno dva za bipy kompleks. Pokazano je da se kompleksi za HSA mogu vezati i nekovalentno, kao i da vezivna mesta diktira oblik kompleksa (hloro, hidrokso ili akva). Pored navedenog, razvijena je i optimizovana metoda za poboljšanje negativne jonizacije peptida upotrebom nano-elektrosprej masene spektrometrije (ESI MS). Metoda podrazumeva dodatak rastvora formaldehida u izopropanolu, nakon elucije uzoraka sa hromatografske kolone. Primenom metode za identifikaciju vezivnih mesta ispitivanih kompleksa proteomskim ―bottom-up‖ pristupom, omogućena je negativna jonizacija peptida koji na sebi nose vezane komplekse rutenijuma. Primećena je redukcija naelektrisanja detektovanih jona (1-) u odnosu na pozitivni jonski mod (3+). Zbog karakteristične izotopske raspodele rutenijuma, prisustvo jednostruko naelektrisanih vrsta olakšava identifikaciju ciljnih vezivnih peptida, bez fragmentacije liganada karakteristiĉne za analizu matriksom-pomognutom laserskom desorpcijom i jonizacijom (engl. matrix-assisted laser desorption and ionization, MALDI). Iz dobijenih rezultata se može zaključiti da kompleksi sa bidentatnim helatnim ligandima koji poseduju sposobnost građenja jakih vodoničnih veza (en i dach) pokazuju značajno veći afinitet za vezivanje transportnih proteina, nego što je to slučaj sa bipy kompleksom. Pored toga, ova osobina pozitivno korelira i sa ispitanom citotoksičnošću kompleksa. Može se zaključiti i da odabrani proteini seruma poseduju potencijal za transport kompleksa, pri čemu je HSA definisan kao glavni vezivni partner za ispitivana jedinjenja. Pored navedenog, u ovoj tezi je stavljen akcenat i na poboljšanje eksperimentalnog pristupa koji uključuje maseno- spektrometrijske metode za strukturnu karakterizaciju vezivanja kompleksa metala za proteine. Po prvi put je opisana upotreba negativne elektrosprej jonizacije za određivanje mesta vezivanja kompleksa metala na proteinima, dajući ovoj tezi i metodološki značaj.

kompleksi rutenijuma(II) ; albumin ; transferin ; interakcije ; vezivna mesta ; MALDI ; ESI ; negativna jonizacija

nije evidentirano