hrvatski

Razvoj HPLC-metode za mjerenje adenilata u rakušca Gammarus fossarum (Amphipoda, Crustacea)

Energijski naboj adenilata (eng. adenylate energy charge, AEC) je pokazatelj energijskog statusa metabolizma stanice, za čiju procjenu je potrebno uzeti u obzir koncentracije sva tri nukleotida – adenozin-trifosfata (ATP), adenozin-difosfata (ADP) i adenozin-monofosfata (AMP) [1]. Promjene u ekološkim ili fiziološkim parametrima dovode do smanjenja AEC. Određivanje i kvantificiranje nukleotida provodi se tehnikama tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti (HPLC), koje su korisne za izolaciju i kvantifikaciju nukleotida u ekstraktima bioloških tkiva. Cilj ovog istraživanja bio je ispitati različite eksperimentalne uvjete ekstrakcije adenilata na uzorcima slatkovodnog rakušca Gammarus fossarum iz Velikog potoka (planina Medvednica) te razviti najprikladniju metodu analize. U pripremi uzorka testirani su različiti tipovi homogenizatora: Potter- Elvehjemov, Ultraturax (Qiagen) i ultrazvučna kupelj, gdje se Potter- Elvehjemov homogenizator pokazao optimalnim rješenjem. Testirana je i homogenizacija u nekoliko različitih otopina: 50 mM NH4HCO3, 0, 5 M CCl3-COOH (trikloroctena kiselina, TCA) i 0, 5 M HClO4 (perklorna kiselina, PCA). Dobiveni kiseli ekstrakt biološkog materijala neophodno je neutralizirati jer u jako lužnatom ili kiselom mediju dolazi do hidrolize fosfatnih veza u adenilatima te su stoga ispitani različiti načini neutralizacije. Najbolji rezultati dobiveni su ekstrakcijom adenilata homogenizacijom u PCA te neutralizacijom s KOH (c=0, 3 M) i fosfatnim puferom pri uvjetima puferiranja smjese soli Na2HPO4 i KH2PO4 ; c=0, 2 M ; pH=8, 2. Također, testirana je primjena ekstrakcije na čvrstoj fazi (Strata X, Phenomenex) za pročišćavanje uzorka pri kojoj se pokazalo da ona ne doprinosi značajno poboljšanju rezolucije kromatograma adenilata, ali doprinosi uklanjanju onečišćenja u slučaju prisutnosti nepoželjnog matriksa. Adenilati su razdvojeni pomoću sustava HPLC na koloni ODS Hypersil C18 (5 m, 125  4 mm) izokratnim eluiranjem (150 mM KH2PO4/K2HPO4, 100 mM KCl i 10 mM tetrabutil amonij hidroksid, TBA kao ionskim parom ; pH=6) [2]uz primijenjeni protok od 1 mL/min. Priprema uzoraka za analizu predstavlja ključni korak te je stoga važno definirati sve uvjete izolacije adenilata iz biološkog materijala za pouzdano određivanje koncentracije AMP, ADP i ATP. Cijeli postupak pripreme uzorka neophodno je provesti u što kraćem vremenu na niskoj temperaturi (<4 °C). Zaključno, ova modificirana metoda omogućuje točnu detekciju adenilata te se AEC može pri tome koristiti kao indeks zdravlja rakušca G. fossarum. Ova vrsta je pogodan bioindikatorski organizam jer je osjetljiv na onečišćenje te se koristi u studijama za procjenu toksičnosti riječnih ekosustava.

Energijski naboj adenilata ; metabolizam ; neutralizacija ; rakušci ; bioindikatori

nije evidentirano