hrvatski

Optimizacija pripreme krvne plazme za određivanje 5-metiltetrahidrofolata

U svrhu što učinkovitijeg praćenja terapije upalnih bolesti crijeva uz analizu koncentracija metabolita tiopurinskih imunosupresiva potrebna je i analiza plazmatskih koncentracija aktivnog oblika folne kiseline, 5-metiltetrahidrofolata (5-MTHF) koji je u ovih pacijenata u potencijalnom nedostatku. Cilj ovog rada bio je razviti jednostavnu i brzu kromatografsku metodu za praćenje obiju skupina analita uz prihvatljivo vrijeme trajanja metode te što manji manualni rad analitičara. Biološki uzorci su složenog sastava, a analiti koji se određuju u vrlo niskim koncentracijama, stoga je potrebno optimizirati pripremu uzorka plazme za analizu 5-MTHF da bi se poboljšala osjetljivost metode te se postigle niže granice određivanja. Također, uzevši u obzir prirodu analita, cilj je pripremiti i stabilan uzorak kako bi se osigurala reprezentativna slika biološkog stanja. RP-HPLC-FLD tehnika korištena je za praćenje koncentracije 5-MTHF u plazmi. U optimizaciji pripreme ispitani su razni omjeri plazme i acetonitrila/metanola (2:1 i 3:1), utjecaj dodane količine antioksidansa askorbinske kiseline (ASK) (od 15 do 90 µg na 200 µL plazme) te ditiotreitola (DTT) (25 µg na 200 µL plazme) te otapala nakon uparivanja uzorka (1 i 3 g/L ASK). U svrhu što boljeg uklanjanja interferencija u uzorku, ispitani su i Phree Phospholipid Removal i Isolute PLD+ sorbensi. Priprema uzorka s 90 µg ASK uz omjer 2:1 MeOH:plazma pokazala je najveću iskoristivost uz najveću površinu pika 2 sata nakon prvog injektiranja, dok je najstabilnija otopina bila ona s dodanih 15 μg ASK i 25 μg DTT, pokazujući najmanje relativno smanjenje površine pika nakon 2 sata. Sorbensi su pokazali manji broj interferirajućih pikova uz nešto manji analitički prinos u odnosu na postupak taloženja proteina. U ovom radu optimizirana je priprema uzorka plazme za analizu 5-MTHF. Daljnjim tijekom istraživanja provest će se i optimizacija pripreme uzorka za analizu tiopurina te će metoda biti validirana. Ovaj rad sufinancirala je Hrvatska zaklada za znanost projektom [UIP-2017-05-3949].

5-metiltetrahidrofolat ; plazma

nije evidentirano