hrvatski

Genotipizacija polimorfizma T13254C u genu za glikoprotein VI analizom krivulje taljenja visoke razlučivosti

Glikoprotein VI (GPVI) je transmembranski glikoprotein iz imunoglobulinske superobitelji prisutan na membrani megakariocita i trombocita. GPVI je receptor za kolagen te je odgovoran za posljedični prijenos signala, otpuštanje trombocitnih granula i agregaciju trombocita. Polimorfizam T13254C (NG_031963.2:g.18038C>T, rs1613662) u genu za GPVI (GP6) uzrokuje zamjenu aminokiseline serin prolinom na položaju 219 te se povezuje s promijenjenom funkcijom trombocita i posljedičnom pojavom trombotičkih događaja, pretežito infarkta miokarda, ishemijskog moždanog udara, ali i venske tromboze [1]. Cilj ovog rada bilo je uvođenje nove brze metode za genotipizaciju polimorfizma GP6 T13254C zasnovane na lančanoj reakciji polimerazom (PCR) analizom krivulje taljenja visoke razlučivosti (engl. high resolution melting, HRM). DNA je izolirana iz uzoraka krvi ispitanika prikupljenih u sklopu projekta HRZZ IP-2014-09-2047 metodom isoljavanja [2]. Genotipizacija primjenom metode PCR-HRM izvedena je na uređaju LightCycler 480 (Roche, Njemačka) uz početnice konstruirane pomoću alata Primer-BLAST [3]. Sekvenciranje je napravljeno na uređaju Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer uz pomoć programa Sequencing Analysis software (verzija 5.2 ; Applied Biosystems, Kalifornija, SAD), te je korišteno kao referentna metoda prilikom određivanja analitičke osjetljivosti. Ispitivanje preciznosti napravljeno je na 3 uzorka različitih genotipa. Za ispitivanje analitičke točnosti, osjetljivosti i specifičnosti, odabrano je 20 uzoraka divljeg tipa, 10 heterozigotnih i 2 homozigotna uzorka. Rezultati su izraženi kao postotak slaganja i 95%-tni interval pouzdanosti (CI), uz kriterij prihvatljivosti ≥ 95%. Prilikom ispitivanja ponovljivosti, međupreciznosti, točnosti i analitičke specifičnosti dobiveno je 100-postotno slaganje rezultata (95% CI = 92, 1% – 100%). Za određivanje analitičke osjetljivosti, slaganje rezultata bilo je 96, 9% (95% CI = 83, 8% – 99, 9%) te je sekvenciranjem uočen jedan uzorak divljeg tipa pogrešno genotipiziran kao homozigot metodom PCR- HRM. Zaključno, metoda PCR-HRM za genotipizaciju polimorfizma GP6 T13254C jest brza, precizna, točna i specifična, ali zahtjeva poseban oprez i provjeru rezultata u slučaju genotipizacije homozigota.

glikoprotein VI, polimorfizam, genotipizacija, analiza krivulje mekšanja visoke razlučivosti, trombofilija

nije evidentirano