hrvatski

Optimiziranje spektrofotometrijske metode za određivanje glutationa u punoj krvi

Glutation je najvažniji tiolni antioksidans u stanicama sisavaca. Smanjena koncentracija GSH dovodi se u vezu s brojnim patofiziološkim procesima te je cilj ovog istraživanja bio optimizirati metodu za određivanje koncentracije GSH u punoj krvi. Za određivanje koncentracije GSH odabrana je spektrofotometrijska metoda koja se temelji na reakciji tiolne skupine GSH i reagensa 5, 5'-ditiol-(2-nitrobenzojeve kiseline), DTNB-a. U reakciji nastaje žuto obojeni produkt TNB (5'-tio-2-nitrobenzojeva kiselina) kojem se na valnoj duljini λ = 412 nm može izmjeriti intenzitet apsorbancije. Koncentracija GSH u uzorku određuje se prema Lambert-Beerovom zakonu iz poznatog apsorpcijskog koeficijenta, Ɛ=14150 M-1 cm-1. Ispitivanja optimizacije metode za određivanje koncentracije GSH u punoj krvi provedena su na istom uzorku krvi, a uzorak krvi pribavljen je od zdravog dobrovoljnog davaoca krvi. Prilikom optimiziranja metode ispitana je kiselina koja se mora upotrijebiti za uklanjanje proteina iz uzorka krvi, molarnost pufera kojim se održava potreban pH reakcijske smjese te sastav reakcijske smjese. Također ispitana je stabilnost GSH tijekom pohranjivanja supernatanta te stabilnost TNB-a, produkta reakcije između GSH i reagensa DTNB-a. Pouzdanost metode ispitana je određivanjem njene linearnosti. Pored toga ispitano je može li se supernatant koji je pripremljen za određivanje GSH upotrijebiti za određivanje još jednog parametra oksidativnog stresa, malondialdehida (MDA). Ispitivanjem je pokazano da je tretiranjem uzoraka pune krvi s 5 % TCA dobiven čisti supernatant koji je pogodan za kolorimetrijsko određivanje GSH. Optimalni uvjeti pH reakcijske smjese postignuti su korištenjem 1 M K-fosfatnog pufera (pH 7, 4), a kao optimalan sastav reakcijske smjese pokazao se sastav: 500 μl supernatanta, 350 μl 1 M K-fosfatnog pufera (pH 7, 4) te 50 μl 1 mM DTNB-a. Obzirom da je pohranjivanje supernatanta u zamrzivaču na -20 °C kroz 48 h dovelo do značajnog pada koncentracije GSH (p< 0, 05), ne preporuča se pohranjivanje supernatanta. Ispitivanjem stabilnosti produkta reakcije TNB-a u vremenu od 45 minuta uočen je blagi pad izmjerenih apsorbancija tijekom 45 minuta koji nije bio statistički značajan (p> 0, 05) te je zaključeno da je produkt stabilan tijekom 45 minuta. Pomoću standarda GSH (koncentracijski raspon u reakcijskoj smjesi 10 - 60 μM) utvrđeno je da je metoda linearna te pouzdana za mjerenje GSH u punoj krvi. Pokazano je da je iz istog supernatanta koji je pripremljen za određivanje GSH moguće odrediti koncentraciju MDA.

Glutation, oksidacijski stres, antioksidans

nije evidentirano