hrvatski

Analiza pirfenidona i njegovog metabolita u složenom biološkom uzorku HPLC-DAD-FLD-MS/MS metodom

Pirfenidon je novi antifibrotski, antioksidativni i protuupalni lijek registriran za terapiju idiopatske plućne fibroze. Uz to pokazuje značajan terapijski potencijal u srčanom, bubrežnom i jetrenom tkivu, zbog čega se i dalje istražuje. Za dio antifibrotskog učinka odgovoran je i njegov glavni metabolit, 5-karboksipirfenidon. Cilj rada bio je razviti selektivnu i osjetljivu analitičku metodu za istovremenu analizu pirfenidona i 5- karboksipirfenidona unutar matriksa složenog biološkog uzorka, desnog ventrikla štakora tretiranog pirfenidonom. U tekućinskoj kromatografiji visoke djelotvornosti korištena je stacionarna faza Symmetry (Waters) C18 (4, 6 × 150 mm, 3, 5 μm) pri temperaturi 28 °C. Ispitane su mobilne faze različitih omjera acetonitrila ili amonijevog formijata i vode. Isprobana je izokratna eluacija i gradijentno ispiranje, kao i različite brzine protoka. Najpovoljnijom se pokazala izokratna eluacija uz sastav ACN:H2O:HCOOH = 50:50:0, 1% i brzinu protoka 0, 4 mL/min, pri čemu su vremena zadržavanja pirfenidona i 5-karboksipirfenidona iznosila 5, 9 i 4, 3 min. Za detekciju su korištena tri detektora: DAD, FLD i MS. DAD je poslužio u preliminarnoj optimizaciji HPLC metode, no za analizu složenih bioloških uzoraka nije bio dovoljno osjetljiv. FLD je pokazao potencijal primjene u detekciji oba spoja, ali zahtijeva daljnju optimizaciju. MS detektorom su analiti selektivno i osjetljivo detektirani u prisustvu kompleksnog matriksa, korištenjem kromatograma izoliranih iona m/z 186 za pirfenidon i m/z 216 za karboksipirfenidon, a također je proučena i njihova MS2 fragmentacija. Paracetamol je odabran kao unutarnji standard na temelju povoljnog vremena zadržavanja (3, 85 min) i svojstava (polarnosti i molekulske mase) bliskih analitima. Za ekstrakciju analita isprobana su otapala čisti i 50%-tni acetonitril te čisti metanol. Također je dodatnom ekstrakcijom zaostalog taloga uzorka vodom provjerena učinkovitost navedenih otapala u izdvajanju polarnijeg 5-karboksipirfenidona. Utvrđeno je da je najbolje otapalo za pirfenidon metanol, dok je 50%-tni acetonitril također zadovoljavajuće ekstrakcijsko sredstvo. Za metabolit 5-karboksipirfenidon 50%-tni acetonitril je osigurao najveću ekstrakcijsku učinkovitost, a i metanol se pokazao prihvatljivim. Čisti acetonitril nije pogodno ekstrakcijsko sredstvo niti za jedan analit.

pirfenidon ; 5-karboksipirfenidon ; HPLC-DAD-FLD-MS/MS ; bioanaliza

nije evidentirano