hrvatski

Konstrukcija modularnog sustava višestrukih sgRNA za istovremeno ciljanje nekoliko lokusa tehnologijom CRISPR- Cas9

Sustav CRISPR-Cas9 sastoji se od dvije osnovne komponente, proteina Cas9 i molekule single guide RNA (sgRNA). Protein Cas9 je endonukleaza koja stvara dvolančani lom u molekuli DNA na temelju komplementarnosti ciljane sekvence s molekulom sgRNA. Fuzijom inaktiviranog proteina Cas9 (dCas9) na katalitičku domenu efektorskog proteina omogućeno je ciljano modificiranje epigenoma bez da nastaje dvolančani lom u molekuli DNA. Istovremenom ekspresijom većeg broja sgRNA i proteina Cas9 u eukariotskoj stanici moguće je ciljati veći broj lokusa odjednom. Plazmidni vektor za ekspresiju proteina dCas9 i više molekula sgRNA različite specifičnosti može se sintetizirati u tehnički jednostavnoj reakciji kloniranjem Golden Gate metodom, koja se temelji na restrikcijskim enzimima tipa IIS koji cijepaju sekvencu izvan mjesta prepoznavanja što omogućava vrlo precizno spajanje većeg broja odsječaka DNA. Cilj ovog istraživanja bio je proširiti sustav CRISPR-Cas9 molekularnim alatima za povezivanje više molekula sgRNA u jedan vektor koristeći enzime Golden Gate sustava te provjeriti njihovo slaganje u Golden Gate sustavu. Uspješno su konstruirani plazmidni vektori s kompatibilnim kohezivnim krajevima dobivenim cijepanjem enzimima Golden Gate sustava, kao i odgovarajući vektori za ugradnju do šest modula sgRNA u okosnicu za transfekciju i koekspresiju fuzijskog proteina dCas9-DNMT3A. Pravilno sklapanje molekularnog alata provjereno je restrikcijskom analizom i/ili lančanom reakcijom polimeraze. Izrada takvog fleksibilnog sustava olakšava modificiranje genoma ili epigenoma proširivanjem postojećeg skupa molekularnih alata s mogućnošću ciljanja do šest lokusa istovremeno.

metoda Golden Gate ; DNMT3A ; plazmidni vektor ; sgRNA

nije evidentirano