hrvatski

Ciljana metilacija DNA promotora gena MGAT3 korištenjem alata CRISPR-Cas9

Sustav CRISPR‐Cas9 omogućava ciljanu modifikaciju i manipulaciju bilo kojeg genomskog lokusa u različitim staničnim linijama. Osnovni princip metode temelji se na navođenju nespecifične nukleaze Cas9 na određeno područje u genomu pomoću molekule sgRNA, u kojoj je 20 nukleotida (nt) na 5' kraju ključno u prepoznavanju komplementarnog slijeda. Prednost sustava CRISPR‐Cas9 je u njegovoj jednostavnoj manipulaciji te mogućnosti simultanog djelovanja više kompleksa CRISPR‐Cas9 vođenih različitim molekulama sgRNA. Modifikacije sustava uključuju fuziju katalitičke domene efektorskog proteina na inaktiviranu nukleazu Cas9 (dCas9), čime je omogućeno ciljano modificiranje genoma i epigenoma bez induciranja dvolančanog loma u molekuli DNA. Modifikacija sustava CRISPR‐Cas9 fuzijom sekvence DNA koja kodira za katalitičku domenu DNA metiltransferaze 3A de novo (DNMT3A) na sekvencu DNA koja kodira za inaktiviranu nukleazu dCas9 preko fleksibilnog Gly4Ser linkera omogućila je ciljanu metilaciju DNA u genomu. Cilj ovoga istraživanja bio je konstruirati epigenetički alat CRISPR‐ Cas9 za ciljanu metilaciju DNA promotora gena MGAT3 blizu mjesta početka transkripcije (TSS) te utvrditi utjecaj metilacije u ciljanoj regiji na regulaciju ekspresije gena MGAT3. Uspješno su dobiveni konstrukti za ciljanu metilaciju kloniranjem sekvenci molekula sgRNA u plazmide. U svrhu kloniranja plazmidnih konstrukata korišten je bakterijski soj E. coli XL10‐Gold. Plazmidni konstrukti uspješno su transficirali staničnu liniju BG1. Efikasnost transfekcije bila je niža zbog veličine plazmidnih konstrukata. Nakon izolacije ukupne RNA, reverzne transkripcije i lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu (qPCR), rezultati pokazuju da nema statistički značajnog smanjenja ekspresije gena MGAT3 u stanicama transfeciranim plazmidnim konstruktima s aktivnom DNMT3A, kao niti u kontrolnim uzorcima. Provjera je li došlo do ciljane metilacije metodom pirosekvenciranja nije provedena zbog nemogućnosti umnažanja bisulfitno konvertirane DNA iz stanica BG1, stoga rezultati qPCR analize ne mogu biti prihvaćeni sa sigurnošću.

ciljano modificiranje genoma i epigenoma ; CpG otok ; DNMT3A ; dCas9 ; stanice BG1 ; ekspresija

nije evidentirano